CRISPR) යනු තුන්වන පරම්පරාවේ ජෙනෝම සංස්කරණ තාක්‍ෂණයකි: CRISPR ලෝකය විප්ලවීය ලෙස වෙනස් කළේය.

ක්ලස්ටර්ඩ් නිතිපතා අන්තර්-අන්තර්ගත කෙටි පැලින්ඩ්‍රොමික් පුනරාවර්තන (CRISPR) යනු තුන්වන පරම්පරාවේ ජෙනෝම සංස්කරණ තාක්‍ෂණයක් වන අතර එය එහි ඉහළ ප්‍රතිදාන ප්‍රතිඵල සමඟ ලෝකය විප්ලවීය ලෙස වෙනස් කර ඇත. එය විවිධ ජීව විද්‍යාත්මක රෝග සහ ආසාදනවලට ප්‍රතිකාර කිරීම සඳහා භාවිතා කර ඇත. විවිධ බැක්ටීරියා සහ අනෙකුත් ප්‍රොකැරියෝට (ආර්කියා වැනි) ෆේජ් වලින් ආරක්ෂා වීමට CRISPR/Cas9 පද්ධති ද ඇත. CRISPR/Cas9 මත පදනම් වූ උපාය මාර්ග මගින් විභවයෙන් වෙනස් වූ ප්‍රතිරෝධක ජාන, පිටපත් කිරීම සහ එපිජෙනටික් නියාමනය ඉලක්ක කර ගනිමින් ත්‍රිත්ව සෘණ පියයුරු පිළිකා (TNBC) වර්ධනය හා ප්‍රගතිය වළක්වා ගත හැකි බව වාර්තා වී ඇත. මෙම චිකිත්සක මැදිහත්වීම් TNBC හි පවා නිරීක්ෂණය කරන ලද ඖෂධ ප්‍රතිරෝධය වැනි අභියෝගාත්මක ගැටළු විසඳීමට උපකාරී විය හැකිය. වර්තමානයේ, භෞතික (ක්ෂුද්‍ර එන්නත් කිරීම, විද්‍යුත් විච්ඡේදනය සහ ජල ගතික ක්‍රම), වෛරස් (ඇඩිනෝ-ආශ්‍රිත වෛරස් සහ ලෙන්ටිවයිරස්) සහ වෛරස් නොවන (ලිපොසෝම සහ ලිපිඩ නැනෝ අංශු) වැනි ඉලක්කගත සෛල වෙත CRISPR/Cas9 ලබා දීමට විවිධ ක්‍රම භාවිතා කරයි. )-අංශු). TNBC හි අණුක හේතූන් අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා විවිධ ආකෘති සංවර්ධනය කර ඇතත්, ජෙනෝම සංස්කරණ මෙවලම් සජීවීව ලබා දීම සඳහා සංවේදී සහ ඉලක්කගත ක්‍රම නොමැතිකම ඒවායේ සායනික යෙදුම සීමා කරයි. සාරාංශයක් ලෙස, මෙම සමාලෝචනය පවතින සාක්ෂි මත පදනම්ව TNBC සඳහා CRISPR/Cas9 ප්‍රතිකාරයේ ප්‍රගතිය, අභියෝග, සීමාවන් සහ අපේක්ෂාවන් පුළුල් ලෙස පරීක්ෂා කරයි. කෘතිම බුද්ධිය සහ යන්ත්‍ර ඉගෙනීමේ සංයෝජනය TNBC ප්‍රතිකාරයේදී CRISPR/Cas9 උපාය මාර්ග වැඩිදියුණු කළ හැකි ආකාරය ද අපි ඉස්මතු කරමු.
පිළිකාව පාලනයකින් තොරව සෛල බෙදීම, සෛල චක්‍ර මුරපොලවල් කඩාකප්පල් කිරීම සහ පිළිකා මර්දන ජානවල (TSGs) විකෘති මගින් සංලක්ෂිත වේ (Matthews et al., 2022). විවිධ වර්ගයේ පිළිකා අතර, පියයුරු පිළිකා කාන්තාවන් තුළ බහුලව දක්නට ලැබෙන පිළිකා වර්ගය වන අතර ලොව පුරා ඉහළ මරණ අනුපාතයක් ඇත (Waks and Winer, 2019). පියයුරු පිළිකා යනු හිස්ටොලොජිකල් සහ ජීව විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ, සායනික ඉදිරිපත් කිරීම සහ හැසිරීම සහ ප්‍රතිකාර සඳහා ප්‍රතිචාරය වැනි විවිධ ලක්ෂණ සහිත විෂමජාතීය රෝගයකි (Weigelt et al., 2010). පියයුරු පිළිකා වර්ගීකරණය පියයුරු පිළිකා රෝග විනිශ්චය සහ පිළිකා පුරෝකථනය සඳහා නිශ්චිත අවබෝධයක් ලබා දෙයි. පොදු ජෛව සලකුණු සහ සායනික ව්‍යාධි විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ භාවිතය පියයුරු පිළිකා වර්ගීකරණය සඳහා ප්‍රධාන නිර්ණායකය වී ඇත (Tsang and Tse, 2019). පියයුරු පිළිකා ප්‍රතිකාර සඳහා පුරෝකථනය සහ ප්‍රතිචාරය ඊස්ට්‍රජන් ප්‍රතිග්‍රාහක (ER), ප්‍රොජෙස්ටරෝන් ප්‍රතිග්‍රාහක (PR), මානව එපීඩර්මල් වර්ධන සාධක ප්‍රතිග්‍රාහක 2 (HER2/neu) සහ හිස්ටොලොජිකල් ශ්‍රේණිය, පිළිකා වර්ගය සහ ශ්‍රේණිය ඇතුළු බොහෝ සාධක මගින් බලපායි. ප්‍රමාණය සහ වසා ගැටිති මෙටාස්ටැසිස් (Al-Tubaiti, 2020). ලුමිනල් A, ලුමිනල් B, HER2-පොහොසත්, බාසල්-සමාන සහ ක්ලෝඩින්-අඩු ඇතුළුව පියයුරු පිළිකාවේ අභ්‍යන්තර අණුක උප වර්ග පහක් හඳුනාගෙන ඇත (Prat et al., 2015). TNBC යනු සියලුම ER, PR සහ HER2 ප්‍රකාශ නොකරන පිළිකා වල අණුක උප වර්ගයකි (Yin et al., 2020). මෙම ව්යාධිජනක ලක්ෂණ TNBC සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති අතර, එහි වේගවත් ප්‍රගතිය සහ වෙනත් ඕනෑම පියයුරු පිළිකා වර්ගයකට වඩා ආක්‍රමණශීලී ස්වභාවය තහවුරු කරයි (Feng et al., 2018). ඊට අමතරව, Peru et al (2000) පියයුරු පිළිකා නැවත වර්ගීකරණය කිරීමට සහ පියයුරු පිළිකාවේ අභ්‍යන්තර උප වර්ග පහක් හඳුනා ගැනීමට ක්ෂුද්‍ර අරා තාක්ෂණය භාවිතා කළේය (Cadenas, 2012). බාසල්-සමාන පියයුරු පිළිකා යනු ත්‍රිත්ව-සෘණ ෆීනෝටයිප් ඇති සහ වේගවත් ප්‍රගතිය සමඟ සම්බන්ධ වන පියයුරු පිළිකාවේ උප වර්ගයකි. සියලුම බාසල්-සමාන පියයුරු පිළිකා සාමාන්‍යයෙන් TNBC ලෙස වැරදි ලෙස හඳුනාගෙන ඇති නමුත් TNBC වන්නේ 77% ක් පමණක් බව සැලකිල්ලට ගත යුතුය; ඊට වෙනස්ව, TNBC වලින් 71–91% ක් බාසල්-සමාන වන අතර, මෙම පියයුරු පිළිකා වර්ග දෙක අතිච්ඡාදනය වන අතර විවිධ වර්ගීකරණයන් නියෝජනය කරන බව පෙන්නුම් කරයි (Wang D.-Y. et al., 2019). පුරෝකථනය පැහැදිලි කිරීමට සහ වත්මන් සහ අනාගත ප්‍රතිකාර සඳහා විභව ප්‍රතිචාර හඳුනා ගැනීමට TNBC හි විෂමජාතීයතාවය සංලක්ෂිත කිරීමේ අවශ්‍යතාවයක් මෙය ඇති කරයි. මීට අමතරව, සියලුම පියයුරු පිළිකා රෝගීන්ගෙන් 15–20% ක් TNBC වන අතර එය වයස අවුරුදු 50 ට අඩු කාන්තාවන් තුළ බහුලව දක්නට ලැබේ. TNBC රෝගීන්ගෙන් ආසන්න වශයෙන් 20% ක BRCA1 හෝ BRCA2 විකෘති වාර්තා වී ඇත (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). අධ්‍යයනවලින් පෙන්වා දී ඇත්තේ TNBC සතුව ඉහළ මට්ටමේ සනාල එන්ඩොතලියල් වර්ධන සාධක, පිළිකා ආශ්‍රිත මැක්‍රෝෆේජ් (TAM), පිළිකා-ආක්‍රමණශීලී ලිම්ෆොසයිට් (TIL) සහ පිළිකා වර්ධනයට සහ සංක්‍රමණයට සම්බන්ධ අනෙකුත් අණු ඇතුළත් සුවිශේෂී ප්‍රතිශක්තිකරණ ක්ෂුද්‍ර පරිසරයක් ඇති බවයි. එබැවින්, TNBC හි ක්ෂුද්‍ර පරිසරය අවබෝධ කර ගැනීම එහි පුරෝකථනය සහ ප්‍රතිකාර සඳහා ඉතා වැදගත් වේ (Fan and He, 2022).
TNBC හි පුරෝකථනය තක්සේරු කිරීමට සහ ඵලදායී ප්‍රතිකාර සහතික කිරීමට, ප්‍රධාන වශයෙන් ER, PR සහ HER2 හඳුනා ගැනීම සඳහා ප්‍රතිශක්තිකරණ රසායන විද්‍යාව (IHC) සහ පියයුරු නියෝප්ලාස්ම් හඳුනා ගැනීම සඳහා මැමෝග්‍රැෆි මත පදනම් වූ නිවැරදි රෝග විනිශ්චය වැදගත් වේ. කෙසේ වෙතත්, මැමෝග්‍රැෆි මගින් නෙරෝසිස් සහ ෆයිබ්‍රෝසිස් වැනි අභ්‍යන්තර පිළිකා ලක්ෂණ ප්‍රමාණවත් ලෙස නිරූපණය කළ නොහැක (දීපක් සිං සහ වෙනත් අය, 2021). දුර්වල පුරෝකථනය සහ රෝග විනිශ්චය වෛද්‍යවරුන් නිවැරදි ඖෂධ නියම කිරීමෙන් වළක්වන බැවින් (චෞද්‍රි, 2020), TNBC රෝගීන් සඳහා සත්කාර වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා විවිධ උපාය මාර්ග භාවිතා කරනු ලැබේ. වර්තමානයේ, ඩොක්සොරුබිසින් සහ සයික්ලොෆොස්ෆමයිඩ් යන ඖෂධ දෙකක් TNBC රෝගීන් සඳහා භාවිතා කරන අතර හොඳ ප්‍රතිඵල පෙන්වා ඇත. ඊට අමතරව, කාබොප්ලැටින් සහ සිස්ප්ලැටින් වැනි අනෙකුත් ප්ලැටිනම් ඖෂධ භාවිතා කරනු ලැබේ (සිකොව් සහ වෙනත් අය, 2015). ඊට අමතරව, ඔලපරිබ්, වේලාපරිබ් සහ PF-01367338 වැනි PARP නිෂේධක TNBC ප්‍රතිකාර සඳහා විභව රසායනික චිකිත්සක ඖෂධ ලෙස භාවිතා කර ඇත (ඉෂිනෝ සහ වෙනත් අය, 2018). Wnt/b-Catenin, NOTCH, සහ Hedgehog සංඥා මාර්ග TNBC ඇතිවීම හා ප්‍රගතිය සඳහා සම්බන්ධ වී ඇති බව වාර්තා වී ඇති බැවින්, මෙම මාර්ගවලට ඖෂධ ඉලක්ක කිරීම වැදගත් උපාය මාර්ගයක් විය හැකිය (Aysola et al., 2013). ශල්‍යකර්ම, විකිරණ චිකිත්සාව සහ රසායනික චිකිත්සාව අද වන විට TNBC සඳහා ප්‍රතිකාරයේ ප්‍රධානතම අංගය ලෙස පැවතුනද, ඉලක්කගත චිකිත්සාව, ප්‍රතිශක්තිකරණ චිකිත්සාව, Cas9n, dCas9 වැනි විවිධ CRISPR ආශ්‍රිත ජාන සංස්කරණ මෙවලම් ඇතුළු නව ප්‍රතිකාර සංවර්ධනය කිරීමේදී සැලකිය යුතු ප්‍රගතියක් ලබා ඇත. , CRISPR/Cas12, ප්‍රයිම් සංස්කරණය සහ CRISPR/Cas9 ඉලක්ක කරගත් ජාන චිකිත්සාව. මෙහිදී අපි TNBC ප්‍රතිකාර සඳහා භාවිතා කරන විවිධ CRISPR ආශ්‍රිත ජාන සංස්කරණ මෙවලම් කෙරෙහි අවධානය යොමු කරමු. ඒ අතර, CRISPR/Cas9 පුළුල් අවධානයක් ලබා ඇත.
Cas9n, Cas9 nickase ලෙසද හැඳින්වේ, එය CRISPR/Cas9 ජෙනෝම සංස්කරණ පද්ධතියෙන් ලබාගත් Cas9 ප්‍රෝටීනයේ ජානමය වශයෙන් ඉංජිනේරුමය ප්‍රභේදයකි (Gupta et al., 2019). එහි මුල් ස්වරූපයෙන්, Cas9 ප්‍රෝටීනයේ නියුක්ලීස් වසම් දෙකක් අඩංගු වේ: RuvC සහ HNH, එහි ප්‍රධාන කාර්යය වන්නේ DNA කෙඳි දෙකෙහිම බෙදීමයි. කෙසේ වෙතත්, Cas9n හි, නියුක්ලීස් වසම් වලින් එකක් වන HNH, ජානමය වශයෙන් විකෘති වී අක්‍රිය වේ. එබැවින්, Cas9n හි HNH වසම ක්‍රියාකාරී නොවේ. RuvC වසම පමණක් ක්‍රියාකාරීව පවතින අතර, Cas9n තනි DNA කෙඳි කපා දැමීමට හෝ බිඳීම් නිර්මාණය කිරීමට ඉඩ සලසයි (Trevino සහ Zhang, 2014). Cas9 හා සසඳන විට, Cas9n හට ඉලක්කගත නොවන බලපෑම් ඵලදායී ලෙස අඩු කළ හැකි අතර සෛල අලුත්වැඩියා යාන්ත්‍රණයන් නිවැරදිව වැඩිදියුණු කළ හැකිය. ද්විත්ව නූල් සහිත DNA වල නිශ්චිත ස්ථානවල බිඳීම් නිර්මාණය කිරීම වැනි විවිධ ගැටළු විසඳීමට Cas9n භාවිතා කළ හැකිය. මෙම අරමුණ සඳහා, Cas9n අණු දෙකක් ඒකාබද්ධ කර එකට භාවිතා කරන ලදී (Yee, 2016). මිශ්‍ර රේඛා කයිනේස් 3 (MLK3) යනු මයිටොජන්-සක්‍රීය ප්‍රෝටීන් කයිනේස් එකක් වන අතර එය TNBC මෙටාස්ටැසිස් අතරතුර ප්‍රධාන නියාමකයෙකු ලෙස ක්‍රියා කරයි (Cronan et al., 2012).
MLK3 හට TNBC පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට මඟ පාදන බහු සංඥා මාර්ග සක්‍රිය කළ හැක. උදාහරණයක් ලෙස, c-Jun N-terminal kinase (JNK) මාර්ගය සෛල චලිතය සහ බාහිර සෛලීය අනුකෘති පරිහානිය නියාමනය කරන අතර, MLK3 JNK මාර්ගය සක්‍රිය කරයි, එමඟින් සෛල චලිතය වැඩි දියුණු කර ආක්‍රමණශීලී ගුණාංග ලබා දෙයි (Rattanasinchai සහ Gallo, 2016). MLK3 EMT ද නියාමනය කරයි. මෙය සිදු කිරීම සඳහා, එය Snail, Slug සහ Twist වැනි පහළට පිටපත් කිරීමේ සාධක සක්‍රිය කරයි. මෙම සාධක එපිටිලියල් සලකුණු ප්‍රකාශනය වළක්වන අතර මෙසෙන්චයිමල් සලකුණු ප්‍රකාශනය ප්‍රවර්ධනය කරයි, එමඟින් මෙටාස්ටැටික් ෆීනෝටයිප් එකක් අත්පත් කර ගැනීමට හේතු වේ (Casalino et al., 2023). ECM ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමේදී සහ ECM පිරිහීමට ලක් කරන matrix metalloproteinases (MMPs) වැනි ප්‍රෝටීන සක්‍රිය කිරීමේදී MLK3 කාර්යභාරයක් ඉටු කරන බව නිරීක්ෂණය වී ඇත. මෙය පිළිකා සෛල ආක්‍රමණයට සහ දුරස්ථ ස්ථාන වෙත පැතිරීමට පහසුකම් සපයයි (Katari et al., 2019). මේ අනුව, පෙර අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ MLK3 TNBC හි තීරණාත්මක කාර්යභාරයක් ඉටු කරන බවයි. රත්තනසින්චායි සහ ගැලෝ MLK3 හි කාර්යභාරය අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා TNBC ආකෘති භාවිතා කළ අතර එය නිශ්චිත සංඥා මාර්ග හරහා පිළිකා වර්ධනය ප්‍රවර්ධනය කරන බව සොයා ගත්හ. ඔවුන් MLK3 සංස්කරණය කිරීමට CRISPR/Cas9n භාවිතා කළ අතර TNBC මෙටාස්ටැසිස් හි සැලකිය යුතු අඩුවීමක් නිරීක්ෂණය කළහ (රත්තතනසින්චායි සහ ගැලෝ, 2016).
dCas9, බොහෝ විට අක්‍රිය Cas9 ලෙස හැඳින්වේ, එය Cas9 ප්‍රෝටීනයේ නවීකරණය කරන ලද ව්‍යුත්පන්න ආකාරයකි. ක්‍රියාකාරී Cas9 මෙන් නොව, dCas9 හි එන්ඩොනියුක්ලීස් ක්‍රියාකාරිත්වය නොමැති අතර, එමඟින් DNA ද්විත්ව-නූල් බිඳීම් ඇති කිරීමට නොහැකි වේ. එබැවින්, DNA අනුපිළිවෙලට කිසිදු වෙනසක් හෝ වෙනස් කිරීමකින් තොරව ජෙනෝමයේ නිශ්චිත කලාප නිශ්චිතව ඉලක්ක කිරීමට dCas9 භාවිතා කළ හැකිය (Wang et al., 2016). dCas9 හි, එන්ඩොනියුක්ලීස් ප්‍රෝටීන දෙකක්, RuvC සහ HNH, වැදගත් ඇමයිනෝ අම්ල අපද්‍රව්‍ය මර්දනය කිරීමෙන් අක්‍රිය කරනු ලැබේ. (Richter et al., 2016). DNA බෙදීමේ ක්‍රියාකාරකම් නොමැතිකම තිබියදීත්, dCas9 ජාන පර්යේෂණ සහ ජෛව තාක්‍ෂණයේ වැදගත් කාර්යභාරයන් ගණනාවක් ඉටු කරයි. උදාහරණයක් ලෙස, එය ජෙනෝමයේ නිශ්චිත කලාප දෘශ්‍යකරණය කිරීමට ඉඩ සලසයි, පිටපත් කිරීමේ නියාමනයට පහසුකම් සපයයි, සහ එපිජෙනටික් වෙනස් කිරීම් ප්‍රවර්ධනය කරයි (Brocken et al., 2018).
ZEB1 (සින්ක් ඇඟිලි E-කොටුව බන්ධන හෝමියෝබොක්ස් 1) පිටපත් කිරීමේ සාධකය, කලලරූපී වර්ධනය, පටක අලුත්වැඩියාව සහ පිළිකා ප්‍රගතිය අතරතුර සිදුවන සෛලීය ක්‍රියාවලියක් වන එපිටිලියල්-මෙසෙන්චයිමල් සංක්‍රාන්තිය (EMT) මැදිහත් වීමේදී නිශ්චිත හා තීරණාත්මක කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි. එයට එපිටිලියල් සෛල මෙසෙන්චයිමල් සෛල බවට පරිවර්තනය වීම ඇතුළත් වන අතර එමඟින් සෛල රූප විද්‍යාව, චලනය, ආක්‍රමණශීලී බව ආදියෙහි වෙනස්කම් ඇති වේ. (Wu et al., 2020). TNBC හි එපිටිලියල් සෛලවල සෛල-සෛල ඇලීම සහ ධ්‍රැවීයතාව පවත්වා ගැනීම සඳහා වගකිව යුතු E-කැදරින් සහ ඔක්ලූඩින් වැනි බහු එපිටිලියල් සලකුණු ZEB1 වළක්වයි (Moreno-Bueno et al., 2008). ඊට අමතරව, ZEB1 N-කැදරින්, vimentin සහ fibronectin (Konradi et al., 2014) වැනි ඇතැම් සලකුණු සක්‍රීය කරන අතර Rho GTPases සහ matrix metalloproteinases (MMPs) (Huang) වැනි සයිටොස්කෙලිටල් ප්‍රතිනිර්මාණයට සම්බන්ධ ජාන නියාමනය කරයි. et al., 2014). 2022), ඊට අමතරව, එය වර්ධන සාධකය-β (TGF-β), Wnt සංඥාකරණය යනාදිය පරිවර්තනය කිරීම වැනි විවිධ සංඥා මාර්ගවලට ද බලපාන අතර එමඟින් TNBC හි පිළිකා ආක්‍රමණය සහ මෙටාස්ටැසිස් ප්‍රවර්ධනය කරයි (චෙන් සහ වෙනත් අය, 2016). බොහෝ අධ්‍යයනයන් සහ විද්‍යාත්මක සාක්ෂිවලින් පෙනී යන්නේ TNBC හඳුනා ගැනීම සහ චිකිත්සක මැදිහත්වීම සඳහා වටිනා නියෝජිතයෙකු ලෙස ZEB1 විශාල විභවයක් ඇති බවයි. මෑත අධ්‍යයනයකදී, Waryah සහ වෙනත් අය TNBC ආකෘතියක් භාවිතා කළ අතර dCas9 මගින් ZEB1 සම්පූර්ණයෙන් මර්දනය කර ඇත. මේ අනුව, ඔවුන් ඉතා ඉහළ නිශ්චිතතාවයක් සහ සජීවී තත්වයන් තුළ ZEB1 සම්පූර්ණයෙන්ම පාහේ නිෂේධනය කිරීම නිරීක්ෂණය කළහ (Waryah සහ වෙනත් අය, 2023).
CRISPR/Cas12 යනු CRISPR/Cpf1 ලෙස හඳුන්වන ජාන සංස්කරණ මෙවලමකි. එය CRISPR/Cas පද්ධතියෙන් ව්‍යුත්පන්න වී ඇති අතර, එහිදී Cas12 යන පදය CRISPR-ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන් 12 (Bharathkumar et al., 2022) වෙත යොමු වන අතර එය Cas9 ට සම්පූර්ණයෙන්ම සමාන වේ. එකම වෙනස වන්නේ එහි Cas12 ප්‍රෝටීනය අඩංගු වීමයි. Cas9 හා සසඳන විට, Cas12 ජාන සංස්කරණ ක්‍රියාවලියේදී ඇලෙන සුළු කෙළවර ජනනය කිරීම වැනි අද්විතීය කාර්යයන් කිහිපයක් ඇති අතර, Cas9 මොට කෙළවර ජනනය කරයි (Wang et al., 2021). Cas12 හි මෙම ගුණාංගය එහි නිශ්චිත DNA හැසිරවීමේ තාක්ෂණයට දායක වේ. ඉලක්කගත DNA නිවැරදිව හඳුනා ගැනීමට සහ කැපීමට හැකියාව ඇති ප්‍රෝටීනයක් ලෙස, එය අසාමාන්‍ය බහුකාර්යතාවයක් ඇති අතර, එය ජාන සංස්කරණය ඇතුළු විවිධ යෙදුම් සඳහා ඵලදායී මෙවලමක් බවට පත් කරයි (Pickar-Oliver සහ Gersbach, 2019).
අනෙකුත් CRISPR ප්‍රභේදවලට සමානව, CRISPR/Cas12 ද TNBC හි ජාන ඉවත් කිරීමට හෝ සක්‍රිය කිරීමට සමත් වන අතර, එහි ව්‍යාධිජනක හෝ ප්‍රතිකාර සඳහා ප්‍රතිචාර දැක්වීමේදී වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරන ජාන ඉලක්ක කර ගනී (Yang සහ Zhang, 2023). මෙම ක්‍රියාවලිය සාක්ෂාත් කර ගැනීම සඳහා, Cas12 ඉලක්කගත ජානයට යොමු කරන මාර්ගෝපදේශක RNA (gRNA) සංවර්ධනය කරන ලදී. Cas12 එහි ඉලක්කයට බන්ධනය වූ පසු, එය DNA වල ද්විත්ව නූල් බිඳීම් හඳුන්වා දෙන අතර DNA අලුත්වැඩියා යාන්ත්‍රණයන් සක්‍රීය කරයි. අලුත්වැඩියා කිරීමේ ක්‍රියාවලියේදී, වැරදි නියුක්ලියෝටයිඩ ඇතුළත් කළ හැකි අතර, එය ජාන විකෘති කිරීම් සහ ක්‍රියාකාරිත්වය නැතිවීමට හේතු වේ (Zhang et al., 2021a). ඊට අමතරව, ජාන සක්‍රිය කිරීම සඳහා Cas12 එන්සයිමයේ (dCas12 ලෙස හැඳින්වේ) වැඩිදියුණු කළ අනුවාදයක් ද භාවිතා කරන ලදී. එය පිටපත් කිරීමේ සක්‍රියකාරකයක් සමඟ ඒකාබද්ධ කිරීමෙන්, ඇතැම් ජාන ප්‍රේරණය කිරීමට හැකි වන අතර එමඟින් ඒවා සක්‍රිය කළ හැකිය. පිළිකා මර්දන ජාන සක්‍රිය කිරීම ප්‍රවර්ධනය කිරීමේදී මෙම තාක්ෂණයට විශාල විභවයක් ඇත (සුල්තාන් et al., 2022).
ප්‍රයිම් සංස්කරණය යනු අලුතින් සංවර්ධනය කරන ලද සහ අතිශයින්ම උසස් ජෙනෝම සංස්කරණ තාක්‍ෂණයකි. එය ජීවියෙකුගේ DNA ඉතා නිවැරදිව වෙනස් කිරීමට සමත් වේ (චෙන් සහ ලියු, 2023). ප්‍රයිම් සංස්කරණය ප්‍රධාන සංරචක දෙකක් ඒකාබද්ධ කිරීම හරහා සාක්ෂාත් කරගනු ලැබේ: වෙනස් කරන ලද CRISPR/Cas9 එන්සයිමයක් සහ ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස්. CRISPR/Cas9 එන්සයිමයේ කාර්යභාරය වන්නේ ජෙනෝමයේ නිශ්චිත ස්ථාන තෝරා බේරා ඉලක්ක කර ගැනීමයි, ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් ඉලක්ක ස්ථානයේ DNA හොඳින් වෙනස් කිරීමට උපකාරී වේ (හසන් සහ වෙනත් අය, 2021). ප්‍රයිමර් සංස්කරණ යාන්ත්‍රණයේදී, පළමු පියවරට ප්‍රයිමර් සංස්කරණ මාර්ගෝපදේශක RNA (pegRNA) නිර්මාණය කිරීම ඇතුළත් වේ (Standage-Beier සහ වෙනත් අය, 2021). ඉලක්කගත DNA හි අපේක්ෂිත සංස්කරණ ස්ථානයට අනුරූප වන ඉලක්ක අනුපිළිවෙල සහ RNA සැකිල්ල එහි අඩංගු වේ. පසුව pegRNA ප්‍රයිමර් සංස්කරණ නියුක්ලීස් (PE2) සමඟ ඉලක්ක සෛල තුළට හඳුන්වා දෙනු ලැබේ. PE2 යනු Cas9 එන්සයිමයක්, ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් එකක් සහ ප්‍රයිමර් සංස්කරණ ඇඩැප්ටරයකින් සමන්විත විලයන ප්‍රෝටීනයකි (Martín-Alonso සහ වෙනත් අය, 2021). සෛලය තුළ, pegRNA සහ PE2 සංකීර්ණ ඒවා වෙනස් කිරීමට අවශ්‍ය නිශ්චිත DNA සොයයි. Cas9 එන්සයිමය DNA කපා තනි කෙඳි වලින් සමන්විත අච්චුවක් නිර්මාණය කරයි (Choi et al., 2022). සංස්කරණය සඳහා DNA සකස් කිරීම සඳහා ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් මෙම අච්චුව භාවිතා කරයි. DNA පිටපත් කිරීම සමඟ, RNA අච්චුව සංස්කරණය කිරීම සඳහා උපදෙස් ද ඇතුළත් වේ. අවසාන වශයෙන්, අලුතින් නිර්මාණය කරන ලද DNA නූල් DNA හි බිඳීම අලුත්වැඩියා කිරීම සඳහා අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කරයි, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස අපේක්ෂිත වෙනස් කිරීම අඩංගු වෙනස් කළ DNA අනුපිළිවෙලක් ඇති වේ (Ochoa-Sanchez et al., 2021). ප්‍රයිමර් සංස්කරණ යාන්ත්‍රණයන් ජානවල පුළුල් විකෘති වලට හේතු විය හැක. එය ලක්ෂ්‍ය විකෘති, ඇතුළත් කිරීම්, මකාදැමීම් සහ ජාන ප්‍රතිස්ථාපන පවා ඉලක්ක කළ හැකිය (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). ප්‍රයිම් සංස්කරණය කිරීම පෙර ජෙනෝම සංස්කරණ තාක්ෂණයන්ට වඩා වාසි කිහිපයක් ලබා දෙයි. මේවාට වැඩි නිරවද්‍යතාවය, අඩු කරන ලද ඉලක්කගත බලපෑම් සහ DNA ද්විත්ව නූල් බිඳීම් මත රඳා නොසිට DNA සංස්කරණය කිරීමේ හැකියාව ඇතුළත් වේ (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9 තාක්ෂණය මුලින් සංවර්ධනය කරන ලද්දේ බැක්ටීරියා ප්ලාස්මිඩ් හුවමාරුවෙන් සහ ෆේජ් ආසාදනයෙන් ආරක්ෂා කිරීම සඳහා වන අතර පසුව එය ජෙනෝම සංස්කරණය සඳහා ඵලදායී RNA-පාදක DNA ඉලක්කගත මෙවලමක් ලෙස නැවත භාවිතා කරන ලදී (ජියැං සහ ඩවුඩ්නා, 2017). ඊට අමතරව, CRISPR/Cas9 පද්ධතිය බැක්ටීරියා සහ පුරාවිද්‍යා ජෙනෝම වලින් පිළිවෙලින් 50% සහ 87% ක පවතින බව වාර්තා වී ඇත (ඉෂිනෝ සහ වෙනත් අය, 2018). CRISPR/Cas9 යනු in vivo සහ in vitro මාතයන් භාවිතා කරමින් ඕනෑම අසාමාන්‍ය ජානමය අනුපිළිවෙලක් මකා දැමීම, ඇතුළත් කිරීම සහ නිවැරදි කිරීම සඳහා විභව මෙවලමකි (Sabit et al., 2021). එපමණක් නොව, CRISPR/Cas9 උනන්දුවක් දක්වන ඉලක්කගත ජාන සඳහා එහි නිශ්චිතභාවය හේතුවෙන් අනුවර්තන ප්‍රතිශක්තිකරණ පද්ධතියේ කොටසක් බව පෙන්වා දී ඇත (චෙන් සහ ෂැං, 2018).
CRISPR/Cas9 හි Cas9 සහ තනි මාර්ගෝපදේශක RNA (sgRNA) අඩංගු වේ. Cas9 යනු බහු ප්‍රෝටීන් සංරචක වලින් සමන්විත එන්ඩොනියුක්ලීස් වේ. ඊට අමතරව, Cas9 හි අද්විතීය ව්‍යුහාත්මක සහ අනුකූලතා ගුණාංග ඇත (Pacesa et al., 2022) එය කොටස් දෙකකින් සමන්විත වන බැවිනි: හඳුනාගැනීම (REC) සහ නියුක්ලීස් (NUC). REC තලය තවදුරටත් කලාප තුනකට බෙදා ඇත: REC1, REC2 සහ පාලම් හෙලික්ස් (Cromwell et al., 2018). NUC කොටස් තුනකින් සමන්විත වේ, එනම් RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH සහ ප්‍රොටොස්පේසර් යාබද මෝටිෆ් (PAM) අන්තර්ක්‍රියා වසම (රූපය 1) (ගීතය සහ වෙනත්., 2016). sgRNA හි CRISPR RNA (crRNA) සහ කුඩා RNA (tracer RNA) ට්‍රාන්ස්කෝඩින් කිරීම (රූපය 1) ඇතුළු සංරචක දෙකක් අඩංගු වේ. sgRNA මගින් Cas9 ප්‍රෝටීනය සම්බන්ධක සමඟ සම්බන්ධ කර ක්‍රියාකාරී සංකීර්ණයක් සාදයි, එය ඵලදායි සංකීර්ණය ලෙසද හැඳින්වේ (Richter et al., 2012). crRNA යනු 18-20 නියුක්ලියෝටයිඩ පාදක යුගලයක් වන අතර එය ඉලක්කගත DNA අනුපිළිවෙල හඳුනා ගැනීමේදී තීරණාත්මක කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි. ඊට අමතරව, crRNA ඉලක්කගත DNA සමඟ යුගල වන අතර, tracrRNA ඉලක්කගත DNA බන්ධනය කිරීම සඳහා Cas9 නියුක්ලියෝටයිඩ සඳහා ස්කැන්ෆෝල්ඩ් ලෙස ක්‍රියා කරයි (Manghwar et al., 2019). අනෙක් අතට, PAM අනුක්‍රමයේ නියුක්ලියෝටයිඩ 3 ක් ඇති අතර, එය ඵලදායි සංකීර්ණය DNA සමඟ බන්ධනය කිරීම තහවුරු කරයි, නිශ්චිත කරයි සහ මැදිහත් වේ. Cas9 ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ උප ඒකක වන RuvC සහ HNH උත්ප්‍රේරක ක්‍රියාකාරිත්වය ඇත (Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021). Cas9 උප ඒකකයේ HNH නියුක්ලියේස් වසම crRNA හා සම්බන්ධ DNA නූල් කැඩී යයි. RuvC න්‍යෂ්ටික වසම අනෙකුත් DNA කෙඳි වෙන් කර ද්විත්ව නූල් බිඳීම් (DSBs) ජනනය කරයි, ඉන්පසු වෙනස් DNA බිඳීම් අලුත්වැඩියා යාන්ත්‍රණ දෙකක් සක්‍රීය වේ (Jiang and Doudna, 2017) (රූපය 1).
රූපය 1. CRISPR/Cas9 (A) පිළිබඳ දළ විශ්ලේෂණය. CRISPR/Cas9 පද්ධතියේ සංරචක: (i). Cas9 එන්ඩොනියුක්ලීස් ඉලක්කගත DNA අනුක්‍රමය කැපීම සඳහා වගකිව යුතු අතර, (ii) crRNA සහ tra-crRNA චයිමේරා විලයනය වීමෙන් ඇතිවන තනි මාර්ගෝපදේශක (sg) RNA. (දෙකක්). Cas9 හි Rec I, Rec II, NUC lobe (HNH සහ Ruv C උප සංරචක වේ) සහ අනුරූප කාර්යයන් සහිත PAM අන්තර්ක්‍රියා වසම (C) වැනි සංරචක කිහිපයක් ඇතුළත් වේ. CRISPR/Cas9 ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණය DNA අනුපිළිවෙල අනුපූරක නොවන සහ අනුපූරක ආකාරවලට වෙන් කරයි (D). CRISPR/Cas9 ජෙනෝමය අදියර තුනකින් සංස්කරණය කරයි: හඳුනා ගැනීම, කැපීම සහ අලුත්වැඩියා කිරීම. නිර්මාණය කරන ලද sg-RNA Cas9 මඟ පෙන්වන අතර අනුපූරක සංරචක crRNA හරහා අපේක්ෂිත අනුපිළිවෙල හඳුනා ගනී. Cas9 5′-NGG-3′ හි PAM අනුක්‍රමය හඳුනාගෙන DNA උණු කර, DNA-RNA දෙමුහුන් සාදමින් සහ ඉරිතැලීම සක්‍රීය කරයි. Cas9 හි HNH වසම අනුපූරක නූල කැඩී යන අතර, RuvC වසම අනුපූරක නොවන නූල කැඩී යයි. CRISPR/Cas9 dsDNA ආකාර දෙකකින් බිඳ දැමීමෙන් අලුත්වැඩියා කරයි: සමජාතීය නොවන අන්ත සම්බන්ධ කිරීම (NHEJ) සහ සමජාතීය-යොමු කරන ලද අලුත්වැඩියාව (HDR). අහඹු DNA අනුපිළිවෙලක් ඇතුළු කිරීමට හෝ ඉවත් කිරීමට හැකි දෝෂ සහිත යාන්ත්‍රණයක් වන එන්සයිම ක්‍රියාවලියක් හරහා විදේශීය සමජාතීය DNA නොමැති විට NHEJ ද්විත්ව කෙඳි සහිත DNA අලුත්වැඩියා කරයි. HDR ඉතා නිශ්චිත වන අතර සමජාතීය DNA සැකිලි අවශ්‍ය වේ.
CRISPR/Cas9-මැදිහත් වූ අලුත්වැඩියා මාර්ගවලට සමජාතීය නොවන අන්ත සම්බන්ධ කිරීම (NHEJ) සහ සමජාතීය-යොමු කරන ලද අලුත්වැඩියා (HDR) යාන්ත්‍රණ ඇතුළත් වේ. NHEJ යනු දෝෂ සහිත මාර්ගයක් වන අතර එයට ඇතුළත් කිරීම හෝ මකා දැමීම ඇතුළත් වන අතර අලුත්වැඩියා යාන්ත්‍රණය අතරතුර කිසිදු රටාවක් අවශ්‍ය නොවේ. එය සම්මත ප්‍රෝටීන ජනනය කිරීම සඳහා අහඹු නියුක්ලියෝටයිඩ භාවිතා කරයි (Abbasi et al., 2021). මෙම අලුත්වැඩියා පද්ධතිය KU සංකීර්ණය, හරස්-අනුපූරක ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ වර්ගය 4 (XRCC-4), DNA අන්ත සැකසුම් එන්සයිම සහ ප්‍රෝටීන් කයිනාස් DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021) වැනි සංකීර්ණ හතරකින් සමන්විත වේ. KU සංකීර්ණ ප්‍රෝටීනයට Ku 70 සහ Ku 80 යන උප ඒකක දෙකක් ඇති අතර, NHEJ යාන්ත්‍රණයේ වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි, මන්ද එය අළුත්වැඩියා කිරීමේ යාන්ත්‍රණය ආරම්භ වන්නේ ඉලක්කගත DNA හි මොට හෝ පාහේ මොට කෙළවරට උප ඒකක දෙකක් (Ku 70 සහ Ku 80) බන්ධනය කිරීමෙනි (Abbasi et al., 2021), තුවාල වූ ස්ථානයට අනෙකුත් NHEJ-ආශ්‍රිත සාධක බඳවා ගැනීම සඳහා ස්කැෆල් එකක් ලෙස සේවය කරයි (Yang et al., 2020). XRCC-4 සහ DNA ligase පිළිවෙලින් ඇමයිනෝ අම්ල 334 සහ 911 කින් සමන්විත වන අතර XRCC4-DNA ligase IV සංකීර්ණය DNA කෙළවර බන්ධනය උත්තේජනය කරයි (Chatterjee et al., 2015). DNA අන්ත සැකසුම් එන්සයිම, පොලිනියුක්ලියෝටයිඩ කයිනේස් 3′-පොස්පේට් ලෙසද හැඳින්වේ, එය DNA අන්ත සැකසුම් එන්සයිමයකි. එයට DNA හි 3′P කාණ්ඩය ඉවත් කර DSB අලුත්වැඩියා කිරීමේදී 5′OH කාණ්ඩය පොස්පරීකරණය කළ හැකිය. එයට SSB අලුත්වැඩියා මාර්ගය භාවිතා කරමින් තනි-නූල් බිඳීම් (SSBs) අලුත්වැඩියා කිරීම ද ඇතුළත් වේ (Chatterjee et al., 2015). ප්‍රෝටීන් කයිනේස් DNA-PKcs යනු PIKKs (ෆොස්ෆැටිඩිලිනොසිටෝල් 3-කයිනේස්-සම්බන්ධිත කයිනේස්) සහ ඇටැක්සියා ටෙලැන්ජියෙක්ටේෂියා විකෘති (ATM) පවුලේ උත්ප්‍රේරක උප ඒකකයකින් මෙන්ම ATM සහ Rad3-සම්බන්ධිත ATR වලින් සමන්විත DNA මත යැපෙන ප්‍රෝටීන් කයිනේස් වේ. නූල් බිඳීම් (DSBs) සහ තනි-නූල් බිඳීම් (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR යනු වඩාත් නිවැරදි හා සුදුසු අලුත්වැඩියා යාන්ත්‍රණයකි, මන්ද තොරතුරු පිටපත් කරනු ලබන්නේ සමජාතීය DNA ද්විත්වයේ නොවෙනස්ව පවතින ආකාරය භාවිතා කරමිනි, නමුත් එයට සහෝදර වර්ණදේහ තිබීම අවශ්‍ය වේ. මෙය ක්ෂීරපායී සෛල චක්‍රයේ S/G2 අවධියේදී සිදු වේ. HDR ප්‍රධාන වශයෙන් යීස්ට් විශේෂවල සිදු වේ, නමුත් NHEJ ක්ෂීරපායින් තුළ ඉතා වැදගත් වේ (බුරුමය සහ වෙනත්, 2006; අබ්බාසි සහ වෙනත්, 2021). සම්පූර්ණ අලුත්වැඩියා යාන්ත්‍රණය රූපය 1 හි දක්වා ඇත.
TNBC ජානමය සහ එපිජෙනටික් අසාමාන්‍යතා නිසා ඇති වන බැවින්, CRISPR/Cas9 භාවිතයෙන් මාරාන්තික ජෙනෝමික්/එපිජෙනොමික් අසාමාන්‍යතා නිවැරදි කිරීම සාධාරණ චිකිත්සක ප්‍රවේශයක් විය හැකිය (චෙන් සහ වෙනත් අය, 2019). ඊට අමතරව, සෛල-විශේෂිත පිටපත් කිරීමේ නියාමනයට සම්බන්ධ සමහර පිටපත් කිරීමේ සාධක පිළිකා සෛලවල අද්විතීය ලක්ෂණ ප්‍රදර්ශනය කළ හැකි අතර, එමඟින් පිළිකා ප්‍රතිකාර සඳහා පිටපත් කිරීමේ නියාමනය විශිෂ්ට ප්‍රවේශයක් විය හැකි බව යෝජනා කරයි (Drost සහ වෙනත් අය, 2017). ඖෂධ සංවර්ධනය සඳහා ජානමය, එපිජෙනටික් සහ පිටපත් කිරීමේ දෝෂ වැනි පිළිකා වල මෙම අණුක ලක්ෂණ උපයෝගී කර ගැනීමෙන් සායනික ප්‍රතිඵල වැඩිදියුණු කළ හැකි අතර පරීක්ෂණ පිරිවැය අඩු කළ හැකිය. CRISPR යනු පිළිකා ඇති කරන ජෙනෝමික් ඉලක්ක හඳුනාගෙන හඳුනා ගැනීමට පමණක් නොව, මිනිස් සෛලවල ඔන්කොජීන සංස්කරණය කිරීමට, මර්දනය කිරීමට සහ එපිජෙනටික් ලෙස වෙනස් කිරීමට ද භාවිතා කළ හැකි විභව ජාන සංස්කරණ මෙවලමකි (වගුව 1) (අහමඩ් සහ වෙනත් අය, 2021). පිළිකා මර්දනකාරක, ඔන්කොජීන සහ ඖෂධ ප්‍රතිරෝධය සමඟ සම්බන්ධ ජාන සෙවීම සඳහා CRISPR තිර කිහිපයක් පවත්වා ඇත. විවිධ TNBC ඔන්කෝජීන සංස්කරණය කිරීම සඳහා CRISPR/Cas9 භාවිතය රූප සටහන 2 හි දක්වා ඇත.
රූපය 2. CRISPR/Cas9 භාවිතා කරමින් විවිධ TNBC ඔන්කෝජීන වල ජාන සංස්කරණය කිරීම මගින් පිළිකා වර්ධනය සහ පරිවෘත්තීය අඩු වේ. මෙම ඔන්කෝජීන අතර TNBC ඇතිවීම සහ පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට සම්බන්ධ වන CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 සහ CXCR7, Crypto1, ROR1 සහ ST8SIA ඇතුළත් වේ.
පිළිකා සෛල සංක්‍රමණය, ආක්‍රමණය සහ එපිටිලියල්-මෙසෙන්චයිමල් සංක්‍රාන්තිය (EMT) ITGA9 සමඟ සම්බන්ධ වේ. පෙර අධ්‍යයනවලින් පෙන්වා දී ඇත්තේ ITGA9 නොච් මාර්ගයේ ප්‍රධාන ක්‍රීඩකයෙකු වන අතර රබ්ඩොමියෝසාර්කෝමා මෙටාස්ටැසිස් හි සිත්ගන්නා කාර්යභාරයක් ඉටු කරන බවයි (Molist et al., 2020). ඊට අමතරව, පියයුරු පිළිකා ඇතුළු පිළිකා වර්ග කිහිපයක රෝගීන්ගේ පුරෝකථනය සමඟ ITGA9 සමීපව සම්බන්ධ වී ඇති බව සොයා ගන්නා ලදී (Wang Z. et al., 2019). ඊට අමතරව, ITGA9 හි ජෛව තොරතුරු විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ TNBC හි එහි ප්‍රකාශනය අනෙකුත් පියයුරු පිළිකා උප වර්ගවලට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ ගොස් ඇති බවයි. ඉහළ ITGA9 මට්ටම් TNBC රෝගීන් තුළ පිළිකා මෙටාස්ටැසිස් සහ නැවත ඇතිවීම සමඟ සම්බන්ධ වේ. CRISPR/Cas9 මගින් ITGA9 ඉවත් කිරීම පිළිකා කඳ සෛල (CSC) වැනි ගුණාංග, පිළිකා ඇන්ජියෝජෙනොසිස්, පිළිකා වර්ධනය සහ TNBC හි β-කැටනින් පිරිහීම ප්‍රවර්ධනය කිරීමෙන් මෙටාස්ටැසිස් අඩු කිරීමට හේතු විය (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 යනු TGF-β පවුලේ සාමාජිකයෙකු වන අතර මුල් කලලරූපී උත්පාදනය, කඳ සෛල නඩත්තුව සහ පිළිකා පරිවෘත්තීය සඳහා ඉතා වැදගත් වේ (Ishii et al., 2021). Tdgf-1 ලෙසද හැඳින්වෙන මෙය, ප්‍රාථමික ස්ට්‍රීක්, මෙසෝඩර්ම් සහ එන්ඩෝඩර්ම් සෑදීම නියාමනය කිරීමට මෙන්ම කළල උත්පාදනය අතරතුර ශරීර අවයව වර්ධනය කිරීමේදී වම්/දකුණු අසමමිතිය ස්ථාපිත කිරීමට සම්බන්ධ වන ඔන්කොජනික් GPI-නැංගුරම් ලා ඇති සංඥා ප්‍රෝටීනයකි (Zhang et al., 2021b). මීට අමතරව, Cripto-1 කඳ සෛල සලකුණක් ලෙස එපිටිලියල්-මෙසෙන්චයිමල් සංක්‍රාන්තිය (EMT) හි සම්බන්ධ වී ඇති බව පෙන්වා දී ඇත (Zhang et al., 2021b). කළල වර්ධනය, ෆයිබ්‍රෝසිස් සහ තුවාල සුව කිරීම වැනි විවිධ ක්‍රියාවලීන් සඳහා පමණක් නොව, පිළිකා ආක්‍රමණය සහ පරිවෘත්තීය සඳහාද EMT ඉතා වැදගත් වේ. ඊට අමතරව, Cripto-1 නොච් ප්‍රතිග්‍රාහක හතරක් සමඟ අන්තර් ක්‍රියා කරන බවත් ඒවායේ පශ්චාත්-පරිවර්තන පරිණතභාවය වැඩි දියුණු කරන බවත් පෙන්වා දී ඇත (Brandstadter සහ Maillard, 2019). මිනිස් පියයුරු පිළිකා සෛල නඩත්තු කිරීම සඳහා නොච් සංඥා මාර්ගය සම්බන්ධ වන බව දන්නා කරුණකි. අධ්‍යයනවලින් පෙන්වා දී ඇත්තේ CRISPR/Cas9-මැදිහත් වූ Crypto-1 ප්‍රතිනිර්මාණය පිළිකා වර්ධනය සහ පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලිය මර්දනය කරන බවයි. එබැවින්, Crypto-1 TNBC සඳහා වැදගත් චිකිත්සක ඉලක්කයක් බවට පත්විය හැකිය (Castro et al., 2015).
XCL12 ප්‍රෝටීනය සහ එහි රසායනික ප්‍රතිග්‍රාහක CXC (CXCR4 සහ CXCR7) පිළිකා සෛල ප්‍රගුණනය, වර්ධනය, සංක්‍රමණය සහ ආක්‍රමණය සඳහා විවිධ භූමිකාවන් ඉටු කරයි (Wu et al., 2015). මෙම රසායනික ප්‍රතිග්‍රාහක, in vivo සහ in vitro ආකෘති දෙකෙහිම බහු සංඥා මාර්ග හරහා TNBC සංවර්ධනය සමඟ සම්බන්ධ වී ඇත (Wu et al., 2015). ඊට අමතරව, CXCR4 සහ CXCR7 සක්‍රිය කිරීම TNBC හි මෙටාස්ටැසිස් වලට වැඩි සංවේදීතාවයක් සහ දුර්වල පුරෝකථනයක් සමඟ සම්බන්ධ වේ (Karn et al., 2022). එබැවින්, CXCR4 සහ CXCR7 ඉවත් කිරීම TNBC ඇතුළුව පියයුරු පිළිකා ප්‍රතිකාර සඳහා ඵලදායී ඖෂධ ඉලක්ක ජාන බවට පත්විය හැකිය. Yang et al. විසින් කරන ලද අධ්‍යයනය. Yang et al (2019) CXCR4 සහ CXCR7 ජාන සම-පහර දීමට CRISPR/Cas9 භාවිතා කළ අතර TNBC ප්‍රගුණනය, වර්ධනය, සංක්‍රමණය සහ ආක්‍රමණය සැලකිය යුතු ලෙස නිෂේධනය කර ඇති බව සොයා ගන්නා ලදී (Yang et al., 2019).
පියයුරු පිළිකා පටක වල TNBC ඔන්කෝජීනයක් වන miR-3662 මට්ටම්වල වැඩි වීමක් නිරීක්ෂණය විය (Yi et al., 2022). miR-3662 හි නොක්ඩවුන් කිරීම පියයුරු පිළිකා පිළිකා වර්ධනය සහ ඉන් වීට්‍රෝ සහ ඉන් විට්‍රෝ යන දෙකෙහිම මෙටාස්ටැසිස් වළක්වන බව පෙන්වා දී ඇත (අගර්වාල් සහ ගුප්තා, 2021). HBP-1 යනු Wnt/-catenin සංඥාකරණයේ ප්‍රබල නිෂේධකයක් වන අතර TNBC සෛලවල miR-3662-මැදිහත් වූ වර්ධනයට වගකිව යුතුය. මෑතකදී, Yi et al. විසින් miR-3662-HBP1 අක්ෂය TNBC සෛලවල Wnt/-catenin සංඥා මාර්ගය නියාමනය කරන බව සොයා ගන්නා ලදී (Yi et al., 2022). එහි පිළිකා-විශේෂිත ප්‍රකාශනය නිසා, miR-3662 TNBC සඳහා විභව චිකිත්සක ඉලක්කයක් විය හැකිය. මේ අනුව, TNBC ප්‍රතිකාර සඳහා නව ඖෂධ සංවර්ධනය කිරීම සඳහා CRISPR/Cas9-මැදිහත් වූ miR-3662 හි නොක්ඩවුන් කිරීම විශිෂ්ට ප්‍රවේශයක් විය හැකිය.
UBR5 යනු 300 kDa නියුක්ලියෝපොස්ෆොප්‍රෝටීනයක් වන අතර එය විවිධ පිළිකා වල පිළිකා උත්පාදනය, පරිවෘත්තීය සහ ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාරයේ ප්‍රධාන නියාමකයෙකු ලෙස හඳුනාගෙන ඇත (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 TNBC සාම්පලවල ඉහළ නියාමනයකට ලක්ව ඇති බවත් එහි ubiquitin ligase ක්‍රියාකාරිත්වය හරහා ප්‍රගුණනය ඇති කිරීමෙන් ERα ක්‍රියාකාරිත්වය උත්තේජනය කරන බවත් වාර්තා වී ඇත (Bolt et al., 2015). ප්‍රාථමික TNBC සාම්පලවල සම්පූර්ණ exome අනුක්‍රමික අධ්‍යයනයන්හි UBR5 හි වැඩි ප්‍රකාශනයක් ද පෙන්නුම් කර ඇති අතර, TNBC සංවර්ධනයේ එහි භූමිකාව යෝජනා කරයි. මීට අමතරව, CRISPR/Cas9-ධාවනය කරන ලද UBR5 මකා දැමීම TNBC මෙටාස්ටැසිස් සැලකිය යුතු ලෙස නිෂේධනය කිරීම සහ පර්යේෂණාත්මක මූසික ආකෘතිවල වර්ධනය පෙන්නුම් කළේය. එපමණක් නොව, වල්-වර්ගයේ මූසික ආකෘතියක UBR5 ඇතුළත් කිරීම එහි සම්පූර්ණ ක්‍රියාකාරිත්වය යථා තත්ත්වයට පත් කළ අතර, අක්‍රිය කළ විකෘති වික්‍රියා වල මෙම බලපෑම නිරීක්ෂණය නොවීය (Liao et al., 2017). UBR5 නොමැතිකම, දුර්වල ඇන්ජියෝජෙනසිස් හේතුවෙන් TNBC හි ඇපොප්ටෝසිස්, නෙරෝසිස් සහ පිළිකා වර්ධනය වැළැක්වීම සමඟ සම්බන්ධ වේ. UBR5 නැතිවීම හේතුවෙන්, දුරස්ථ අවයව වලට පිළිකා පැතිරීම අඩු වන අතර, UBR5 අසාමාන්‍ය EMT ඇති කරයි, ප්‍රධාන වශයෙන් E-කැදරින් ප්‍රකාශනය අඩු කිරීමෙන් (Zhang සහ Weinberg, 2018). මෑතකදී, E3 සර්ව-ප්‍රේරිත ක්‍රියාකාරකම් නොමැතිකම හේතුවෙන් TNBC හි IFN-γ-ප්‍රේරිත PDL1 පිටපත් කිරීමේදී UBR5 ඉතා වැදගත් සාධකයක් බව පෙන්වා දෙන ලදී. RNA පිටපත් කිරීමේ විශ්ලේෂණයෙන් හෙළි වූයේ UBR5 IFN-γ මාර්ගයට සම්බන්ධ ජාන මත පද්ධතිමය බලපෑම් ඇති කළ හැකි බවත්, ප්‍රෝටීන් කයිනාස් RNA (PKR) සහ එහි සංඥා සම්ප්‍රේෂක සහ සක්‍රියකාරකවල සක්‍රියකරණ මට්ටම් වැඩි කිරීමෙන් PDL1 සම්ප්‍රේෂණ සක්‍රිය කිරීම ප්‍රවර්ධනය කළ හැකි බවත්ය. පිටපත් කිරීම 1 (STAT1) සහ ඉන්ටර්ෆෙරෝන් නියාමන සාධකය 1 (IRF1). කෙසේ වෙතත්, CRISPR/Cas9-මැදිහත් වූ ඒකාබද්ධ ඉවත් කිරීම UBR5 සහ PD-L1 ප්‍රකාශනය අවහිර කිරීමට වඩා සහසම්බන්ධ චිකිත්සක බලපෑමක් ඇති කරයි, පිළිකා ක්ෂුද්‍ර පරිසරයට ගැඹුරු බලපෑම් ඇති කරයි (Wu et al., 2022). මේ අනුව, CRISPR/Cas9 UBR5 ක්‍රියාකාරිත්වය නිෂේධනය කිරීමට වැදගත් මෙවලමක් විය හැකි අතර එමඟින් TNBC මෙටාස්ටැසිස් සහ පිළිකා වර්ධනය මර්දනය කරයි.
ROR1 යනු පිළිකා සහ කළල වර්ධනයේදී ප්‍රකාශ වන I වර්ගයේ ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් ප්‍රෝටීනයක් වන අතර එය ඔන්කොෆෙටල් ප්‍රෝටීනයක් ලෙස හඳුනාගෙන ඇත (Nicholas Borcherding, 2014). විවිධ මිනිස් පිළිකා වල ආක්‍රමණශීලී හැසිරීම ROR1 ඉහළ නියාමනය සමඟ සම්බන්ධ වේ. ROR1 ඉලක්ක කරගත් චිකිත්සක සංයෝග සම්බන්ධ වී ඇති in vivo සහ in vitro අධ්‍යයනයන්ගෙන් පොරොන්දු වූ ප්‍රතිඵල ලබාගෙන ඇත (Chien et al., 2016). පියයුරු පටක ජෛව පරීක්ෂණවල ROR1 mRNA මට්ටම් ඉහළ යාම ආක්‍රමණශීලී බාසල් වැනි පියයුරු (BL) පිළිකා සහ ශරීරයේ අනෙකුත් කොටස් වෙත සංක්‍රමණය වීම සමඟ ද සම්බන්ධ වී ඇත. එපමණක් නොව, ROR1 හි අධික ප්‍රකාශනය TNBC වර්ධනය සඳහා පුරෝකථන සලකුණක් ලෙස හඳුනාගෙන ඇත (Chien et al., 2016). කෙසේ වෙතත්, TNBC වර්ධනය සහ මෙටාස්ටැසිස් මර්දනය කිරීම සඳහා CRISPR/Cas9 භාවිතයෙන් ROR1 නිහඬ කිරීම ඵලදායී උපාය මාර්ගයක් වනු ඇත.
සියලිලේෂන් ක්‍රියාවලියට ග්ලයිකොකොන්ජුගේට් වලට සියලික් අම්ලය එකතු කිරීම ඇතුළත් වන අතර එය සියලයිල්ට්‍රාන්ස්ෆෙරේස් (STs) මගින් උත්ප්‍රේරණය වේ. ST8SIA1 ST පවුලට අයත් වන අතර ලිම්ෆොසයිටික් ලියුකේමියාව සහ කොලරෙක්ටල් පිළිකා වැනි විවිධ රෝග වල ව්‍යාධිජනක ක්‍රියාවලියේදී වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි (චැං සහ වෙනත් අය, 2018). RNA අනුක්‍රමික විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ ST8SIA1 TNBC රෝගීන්ගේ පියයුරු පටක වල බෙහෙවින් ප්‍රකාශ වන අතර පිළිකා මර්දන ජානය p53 හි විකෘති සමඟ ධනාත්මකව සහසම්බන්ධ වන අතර එය TNBC හි ව්‍යාධිජනකයට දායක විය හැකිය (බට්ටුලා සහ වෙනත් අය, 2017). ඊට අමතරව, ST8SIA1 TNBC හි මෙටාස්ටැසිස් සහ පුනරාවර්තනයට සම්බන්ධ වන අතර, එය TNBC ඇතිවීමේ සහ සංවර්ධනයේ වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරන බව යෝජනා කරයි. TNBC හි විට්‍රෝ ආකෘතියක, CRIPSR/Cas9 විසින් ST8SIA1 තට්ටු කිරීම වර්ධනය සහ මෙටාස්ටැසිස් අවහිර කරන බව පෙන්වා දෙන ලදී (බට්ටුලා සහ වෙනත් අය, 2017). මෙයින් ඇඟවෙන්නේ TNBC ප්‍රතිකාරයේදී ST8SIA1 ඔන්කෝජීනයේ ක්‍රියාකාරිත්වය නිෂේධනය කිරීම සඳහා CRISPR/Cas9 වැදගත් මෙවලමක් විය හැකි බවයි.
NAT1 යනු පරිවෘත්තීය එන්සයිමයක් වන අතර එය අදියර II සෙනෝබයොටික් සංයෝග සෑදීම උත්ප්‍රේරණය කරන අතර එය මිනිස් පටක සියල්ලෙහිම පාහේ ප්‍රකාශ වේ. ඇරෝමැටික ඇමයින් උපස්ථරයක් නොමැති විට පවා ඇසිටිල්-CoA (ඇසිටිල්-CoA) ඉලක්ක කර ගැනීම සඳහා NAT1 හට සහකාරක ෆෝලේට් භාවිතා කළ හැකිය (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). අධ්‍යයනවලින් පෙන්වා දී ඇත්තේ NAT1 පියයුරු පිළිකා සෛල ආකෘතිවල matrix metalloproteinase 9 (MMP9) ක්‍රියාකාරිත්වය නියාමනය කරන බවත් ග්ලූකෝස් සාගින්න අතරතුර ප්‍රතික්‍රියාශීලී ඔක්සිජන් විශේෂ (ROS) වලින් ආරක්ෂා කරන බවත්ය (Wang et al., 2018). NAT1 මකා දැමීම පයිරුවේට් ඩිහයිඩ්‍රොජිනේස් සංකීර්ණය වළක්වන බව පෙන්වා දී ඇති අතර එය මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අක්‍රියතාවයට හේතු වේ (Wang L. et al., 2019). ඊට අමතරව, කුඩා අණු සහ siRNA නිශ්ශබ්ද කිරීම භාවිතා කරමින් NAT1 නිෂේධනය පියයුරු පිළිකා සෛලවල ආක්‍රමණශීලී බව සහ ප්‍රගුණනය අඩු කළ හැකි බව වෙනත් විවිධ වාර්තා පෙන්වා දී ඇත (Stepp et al., 2018). මෑතකදී, පියයුරු පිළිකා සෛල රේඛාව වන MDA-MB-231 හි NAT1 මර්දනය කිරීම සඳහා CRISPR/Cas9 භාවිතා කරන ලද අතර එය එහි ප්‍රකාශන මට්ටම අනුව සෛලීය පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලියට බලපායි. මෙම අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කළේ TNBC හි ප්‍රගතිය සහ පරිවෘත්තීය ක්‍රියාවලිය සඳහා NAT-1 ඉතා වැදගත් බවයි (Carlisle et al., 2020).
ඔන්කොජීන වල සම්බන්ධීකරණ පිටපත් කිරීම සුපිරි වර්ධක, පිටපත් කිරීමේ සාධක සහ සහ සාධක මගින් නියාමනය කරනු ලැබේ (Hnisz et al., 2015). ඊට අමතරව, CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, සහ CDK13 වැනි සයික්ලින්-යැපෙන කයිනේස් (CDKs) සමූහයක් පිටපත් කිරීමේ නියාමනය සඳහා අවශ්‍ය වේ. ඒවා අතර, CDK7 RNA පොලිමරේස් II හි පොස්පරීකරණයට සම්බන්ධ වන අතර එය TNBC හි ව්‍යාධිජනක ක්‍රියාවලියේදී ඔන්කොජීන් පිටපත් කිරීම ආරම්භ කිරීම සහ ප්‍රසාරණය කිරීම සඳහා ඉතා වැදගත් වේ. ශුක්‍රාණු අධ්‍යයනයක දී, CRISPR/Cas9 මගින් CDK7 මකා දැමීම TNBC නිෂේධනය කළ අතර, TNBC හි ව්‍යාධිජනකය CDK7 මත රඳා පවතින බව පෙන්නුම් කරයි (Wang Y. et al., 2015).
MYC සහ RBP (RNA බන්ධන ප්‍රෝටීන්) වල විකෘති ඇපොප්ටෝසිස් වලට හේතු විය හැකි බව අධ්‍යයනවලින් පෙන්වා දී ඇති අතර, MYC හෝ RBP වල තනි ජාන විකෘති පිළිකා සෛල වර්ධනයට බලපාන්නේ නැත (අයින්ස්ටයින් සහ වෙනත් අය, 2021). CRISPR/Cas9-පාදක පුස්තකාලයක් භාවිතයෙන් මිනිස් ජෙනෝමයේ RBP 1000 කට වඩා පරීක්ෂා කර ඇත. ඒවා අතර, ඉතා ඉහළ MYC මට්ටම් සහිත පිළිකා සෛල වර්ධනය සඳහා RBP 57 ක් ඉතා වැදගත් බව සොයා ගන්නා ලදී (Wheeler සහ වෙනත් අය, 2020). ඊට අමතරව, TNBC සෛල වර්ධනය පවත්වා ගැනීම සඳහා YTHDF2 වැදගත් වන අතර ඉහළ MYC ප්‍රකාශනයක් සහිත පිළිකා සෛලවල ඉහළ මට්ටමේ පිටපත් කිරීම සහ පරිවර්තනය අතරතුර මෙතිලේටඩ් පිටපත් ප්‍රමාණය අඩු කරයි. ඊට අමතරව, TNBC රෝගීන්ගේ පැවැත්ම දිගු කිරීම සඳහා ඉහළ MYC මට්ටම් මත අඩුවෙන් රඳා පවතින පිළිකා සෛල සඳහා YTHDF2 අත්‍යවශ්‍ය නොවේ (අයින්ස්ටයින් සහ වෙනත් අය, 2021), එය TNBC ජය ගත හැකි ඖෂධ සඳහා විභව චිකිත්සක ඉලක්කයක් විය හැකි බව යෝජනා කරයි.
සින්ක් ඇඟිලි ප්‍රෝටීන (ZNFs) මුළු මිනිස් ජෙනෝමයෙන් ආසන්න වශයෙන් 1% ක් පමණ වේ. අධ්‍යයනවලින් පෙන්වා දී ඇත්තේ ZNF හට අක්මා පිළිකා, පියයුරු පිළිකා සහ මහා අන්ත්‍ර පිළිකා වැනි විවිධ පිළිකා වල සෛල ප්‍රගුණනය නියාමනය කළ හැකි බවයි (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). CRISPR knockout මගින් ජනනය කරන ලද පුස්තකාල පියයුරු පිළිකා සෛලවල විවිධ පිළිකා මර්දන ජාන (TSGs) පරීක්ෂා කිරීමට භාවිතා කර ඇත (Shalem et al., 2014). එතැන් සිට, CRISPR/Cas9 ZNF319-මකා දැමූ පියයුරු පිළිකා සෛල පිළිබඳ පිටපත් කිරීමේ අධ්‍යයනයකින් පෙන්වා දී ඇත්තේ ZNF319 යනු පියයුරු පිළිකා ප්‍රගුණනය අඩු කරන පිළිකා මර්දන ජානයක් බවත් එම නිසා විවිධ විභව සංඥා යාන්ත්‍රණ සහ අනෙකුත් ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් වලට සම්බන්ධ වන බවත්ය (Wang L. et al., 2022).
ෆෙරොප්ටෝසිස් යනු යකඩ පැවතීම මත රඳා පවතින ක්‍රමලේඛිත සෛල මරණ වර්ගයකි. ෆෙරොප්ටෝසිස් වර්ධනයට ලිපිඩ පෙරොක්සයිඩ් පැවතීම බලපාන බව දන්නා කරුණකි. ඊට අමතරව, PKCβII මුල් ලිපිඩ පෙරොක්සිකරණය පෙන්නුම් කරන බව වාර්තා වී ඇති අතර, වැඩිවන ලිපිඩ පෙරොක්සිකරණය ෆෙරොප්ටෝසිස් සමඟ සම්බන්ධ වේ. CRISPR/Cas9-මැදිහත් වූ කයිනේස් නිෂේධකවල පුස්තකාලයක් පරීක්ෂා කිරීමෙන් හෙළි වූයේ PKCβII ලිපිඩ පෙරොක්සිකරණ ක්‍රියාවලියට සම්බන්ධ වන බවයි, එය MDA-MB-231 සෛලවල ෆෙරොප්ටෝසිස් සඳහා ඉතා වැදගත් වේ (Zhang et al., 2022). එමනිසා, මෙයින් ඇඟවෙන්නේ CRISPR/Cas9 මගින් PKCβII ඉවත් කිරීම ෆෙරොප්ටෝසිස් ආශ්‍රිත රෝග සඳහා ප්‍රතිකාර කිරීම සඳහා විභව පිළිකා මර්දන ජාන ඉලක්කයක් විය හැකි බවයි (Zhang et al., 2022).
පිළිකා රෝගීන්ගේ මරණ වලින් ආසන්න වශයෙන් 90% කටම ඖෂධ ප්‍රතිරෝධය වගකිව යුතු යැයි විශ්වාස කෙරෙන අතර එය පිළිකා ප්‍රතිකාරයේ ප්‍රධාන අභියෝගයකි (බුකොව්ස්කි සහ වෙනත් අය, 2020). ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ ඖෂධ පිටාර ගැලීම, DNA අලුත්වැඩියාව, ඇපොප්ටෝසිස් සහ විවිධ සෛල සංඥා මාර්ගවලට අදාළ ජාන ප්‍රමාණවත් සංඛ්‍යාවක් ඖෂධ ප්‍රතිරෝධය සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති බවයි (හයිඩර් සහ වෙනත් අය, 2020). ඒවා අතර, ජාන කිහිපයක් CRISPR/Cas9 මෙවලම් මගින් ඉලක්ක කර ඇති අතර ඖෂධ ප්‍රතිරෝධය අඩු කිරීම සහ පිළිකා නාශක ප්‍රතිකාරවල කාර්යක්ෂමතාව වැඩි කිරීම සඳහා පොරොන්දු වූ ප්‍රතිඵල පෙන්වා දී ඇත (වාඝාරි-ටබාරි සහ වෙනත් අය, 2022). ඊට අමතරව, ඉහළ ප්‍රතිදාන CRISPR/Cas9 ජාන පිළිමළුන් පිටුදැකීමේ පරීක්ෂණ පුස්තකාල විභව ඖෂධ ප්‍රතිරෝධක ජාන ඉලක්කවල ක්‍රියාකාරිත්වය වෙනස් කිරීමේදී සම්බන්ධ වී ඇත (Shalem සහ වෙනත් අය, 2015). පැක්ලිටැක්සල් ප්‍රතිරෝධක ජාන හඳුනා ගැනීම සඳහා, පුනරාවර්තන TNBC රෝගීන්ගේ ඖෂධ ප්‍රතිරෝධය සමඟ සම්බන්ධ වන හිස්ටෝන් ඩීඇසිටිලේස් 9 (HDAC9) ඇතුළුව අපේක්ෂක ජාන අටක් හඳුනා ගැනීම සඳහා ජෙනෝමය පුරා sgRNA පුස්තකාල පරීක්ෂාව සමඟ RNA අනුක්‍රමණය භාවිතා කරන ලදී (B et al., 2020). තවත් අධ්‍යයනයක දී, පිළිකා නාශක ඖෂධ සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද TNBC රෝගීන්ගේ පැවැත්මේදී ඩයිසෙරීන්/ත්‍රෙයොනීන් සහ ටයිරොසීන් ප්‍රෝටීන් කයිනාස් (DSTYK) වැඩි ප්‍රකාශනයක් නිරීක්ෂණය විය. එපමණක් නොව, DSTYK හි CRISPR/Cas9-මැදිහත් වූ නොක්ඩවුන් ඉන් විට්‍රෝ (SUM102PT සෛල සහ MDA-MB-468 සෛල) සහ ඉන් වීවෝ TNBC ආකෘතියේ ඇපොප්ටෝසිස් සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි දියුණු කළේය (Ogbu et al., 2021).
TNBC හි MAPK මාර්ගයේ අසාමාන්‍ය සක්‍රියතාවයක් තිබුණද, MEK-ඉලක්කගත ප්‍රතිකාරවල සායනික බලපෑම දුර්වලයි. CRISPR/Cas9 ජෙනෝමික් පුස්තකාල තිරයකින් හෙළි වූයේ PSMG2 (ප්‍රෝටියෝම් එකලස් කිරීමේ චැපෙරෝන් 2) නිෂේධනය TNBC BT549 සහ MB468 සෛල MEK නිෂේධකය AZD6244 වෙත සංවේදී කරන බවයි. PSMG2 හි CRISPR/Cas9 නිෂ්කාශනය සාමාන්‍ය ප්‍රෝටියෝම් ක්‍රියාකාරිත්වය වෙනස් කළ අතර, එය PDPK1 හි ස්වයංක්‍රීය භක්ෂක-මැදිහත් වූ විසුරුවා හැරීමට හේතු වූ අතර, එමඟින් AZD6244 (MEK නිෂේධකය) සහ MG132 (ප්‍රෝටියෝම් නිෂේධකය) මගින් ප්‍රේරණය කරන ලද TNBC මූසික ආකෘතිවල පිළිකා සෛල තවදුරටත් වැඩිදියුණු විය. මේ අනුව, පිළිකා සෛල ප්‍රගුණනය අඩු කිරීම සඳහා ප්‍රෝටියෝම් සහ MAP කයිනේස් (MEK) නිෂේධක සහජීවනයෙන් පරිපාලනය කළ හැකිය (Wang X. et al., 2022).
TNBC ප්‍රතිරෝධයට තුඩු දෙන ජාන ක්‍රියාකාරිත්වය නැතිවීම සඳහා පරීක්ෂා කිරීම සඳහා CRISPR/Cas9 ද භාවිතා කර ඇත (Shu et al., 2020). Ge et al විසින් TNBC හි BET බ්‍රෝමොඩොමේන් නිෂේධකයක් (BBDI) වන JQ1 සමඟ ප්‍රතිකාර කරන පිළිකා සෛලවල ඖෂධ ප්‍රතිරෝධයේ යාන්ත්‍රණය පැහැදිලි කරන ලදී. CRISPR/Cas9 භාවිතා කරමින්, rb1 ජානය මකා දැමීමෙන් TNBC පිළිකා නාශක ඖෂධ JQ1 වලට ප්‍රතිරෝධී වන බව ඔවුන් සොයා ගත්හ. එබැවින්, TNBC හි JQ1 ඖෂධ වලට ප්‍රතිචාර දැක්වීමේදී rb1 ක්‍රියාකාරිත්වය වැදගත් වේ. පැක්ලිටැක්සල් CDK4/6 කයිනාස්/ක්ෂුද්‍ර නල නිෂේධකයක් බවත්, JQ1 වැනි BBDI සමඟ එහි සංයෝජනය ඖෂධ-ප්‍රතිරෝධී TNBC සඳහා පොරොන්දු වූ චිකිත්සක ප්‍රතිචාර සැපයිය හැකි බවත් ඔවුන් වාර්තා කළහ (Ge et al., 2020).
දිගු කේතනය නොකරන ලද RNA (lncRNA) වල පිටපත් කිරීමේ භූ දර්ශනය TNBC හි නව සහකාර චිකිත්සාවට ප්‍රතිරෝධය සඳහා වගකිව යුතු බව වාර්තා වී ඇත. මෙම අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ විවිධ MALAT1 lncRNA පිටපත් පහක් TNBC හි බෙහෙවින් ප්‍රකාශ වන බවයි. මීට අමතරව, CRISPR/Cas9-මැදිහත් වූ MALAT1 මකා දැමීම TNBC BT-549 සෛලවල පැක්ලිටැක්සල් සහ ඩොක්සොරුබිසින් වලට සංවේදීතාව වැඩි කළ අතර, TNBC හි MALAT1 ප්‍රතිරෝධය සඳහා විභව භූමිකාවක් යෝජනා කරයි (Shaath et al., 2021).
BRCA1 (BRCA1m) හි විකෘති විෂමජාතීය වන අතර එබැවින් හඳුනා ගැනීමට අපහසු වේ. BRCA1 හි කෘතිම මාරාන්තික සහකරු වන PARP1 (පොලි (ADP-රයිබෝස්) පොලිමරේස්) ඉලක්ක කර ගැනීම, TNBC ඖෂධ රසායනික සංවේදීතාව වැඩි කළ හැකිය. CRISPR/Cas9 භාවිතා කරමින්, PARP1 මකා දැමීම ඩොක්සොරුබිසින්, ජෙම්සිටබයින් සහ ඩොසෙටැක්සල් වැනි පිළිකා නාශක ඖෂධවල mBRCA1 විකෘති TNBC සෛල වලට සංවේදීතාව වැඩි කළ අතර, PARP1 TNBC හි ඖෂධ ප්‍රතිරෝධයට ද සම්බන්ධ වන බව යෝජනා කරයි (Vaghari-Tabari et al., 2022). . පිළිකා මර්දන ජාන BRCA1 හෝ BRCA2 හි විකෘති කිරීම් මිනිසුන් තුළ පියයුරු පිළිකා වර්ධනය වීමේ සම්භාවිතාව වැඩි කරන බව දන්නා කරුණකි. මෙම රෝගීන්ට ප්‍රතිකාර කිරීම සඳහා PARP නිෂේධක භාවිතා කිරීම අවශ්‍ය වේ. මීට අමතරව, CRISPR/Cas9 භාවිතා කරමින් නියුක්ලියෝටයිඩ ගැලවීමේ සාධකය DNPH1 ඉවත් කිරීමෙන් විෂ සහිත නියුක්ලියෝටයිඩ 5-හයිඩ්‍රොක්සිමීතයිල්ඩියෝක්සියුරිඩින් (hmdU) මොනොපොස්පේට් ඉවත් කළ හැකි බවත්, එමඟින් PARP නිෂේධක (Fugger) වලට සංවේදීතාවයට BRCA- ඌනතා සෛලවල ප්‍රතිචාරය වැඩි දියුණු කළ හැකි බවත් ඔප්පු වී ඇත. et al., 2021). මේ අනුව, CRISPR/Cas9 සහ PARP1 නිෂේධක TNBC සඳහා වැදගත් ප්‍රතිකාර උපාය මාර්ගයක් බවට පත්විය හැකිය.
විනිවිද යන ග්ලයිකොප්‍රෝටීන් (P-gp) ජානය යනු බහු ඖෂධ ප්‍රතිරෝධක ජානයක් වන අතර එය සාමාන්‍යයෙන් සියලුම TNBC වලින් ආසන්න වශයෙන් 41% ක පමණ නියාමනය කර ඇත (Sun et al., 2020). P-gp-ප්‍රේරිත ඖෂධ පිටාර ගැලීම පියයුරු පිළිකාවේ ඖෂධ ප්‍රතිරෝධයේ ප්‍රධාන නියාමකයෙකු ලෙස හඳුනාගෙන ඇත. P-gp නිෂේධක පියයුරු පිළිකාවේ පිළිකා නාශක ඖෂධ සඳහා වැඩි සංවේදීතාවයක් පෙන්නුම් කර ඇත (Famta et al., 2021). මේ අනුව, CRISPR/Cas9-මැදිහත් වූ P-gp සහ P-gp නිෂේධක ඉවත් කිරීම හෝ මර්දනය කිරීම TNBC හි ඖෂධ ප්‍රතිරෝධය ජය ගැනීම සඳහා ඉතා වැදගත් ක්‍රම විය හැකිය.
ATP-බන්ධන කැසට් ප්‍රවාහක G2 (ABCG2) TNBC හි ඖෂධ ප්‍රතිරෝධය ඇති කරන බව දන්නා කරුණකි (Palasuberniam et al., 2015), නමුත් CRISPR/Cas9 සහ ABCG2 නිශ්ශබ්ද කිරීම සහ පිළිකා මර්දන ජාන අක්‍රිය කිරීම අතර සම්බන්ධතාවය පිළිබඳ වාර්තා දැනට නොමැත. PTEN ABCG2 සක්‍රිය කිරීම වැඩි දියුණු කළ හැකිය (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). එබැවින්, ABCG2 ඉවත් කිරීමට CRISP/Ca9 භාවිතා කිරීම සහ එය ABCG2 නිෂේධකයක් සමඟ ඒකාබද්ධ කිරීම TNBC හි ඖෂධ ප්‍රතිරෝධය ජය ගැනීම සඳහා සුදුසු ප්‍රතිකාරයක් විය හැකිය. වගුව 2 සියලුම ප්‍රතිරෝධක ජාන ඉලක්ක කරගත් CRISPR/Cas9 ගැන සඳහන් කරයි.
වගුව 2. CRISPR/Cas9 විවිධ TNBC ප්‍රතිරෝධක ජාන ඉලක්ක කරගනිමින් සෛල පිළිකා නාශක ඖෂධ වලට සංවේදී කරයි.
CRISPR/Cas9 පුස්තකාල යනු පිළිකා ව්‍යාධිජනකය හා සම්බන්ධ ජාන විකෘති පරීක්ෂා කිරීම සඳහා විභව මෙවලම් වේ (Chan et al., 2022). මෙම පරීක්ෂණ ක්‍රමයට (අ) පුස්තකාල ගොඩනැගීම, (ආ) ලෙන්ටිවයිරල් සම්ප්‍රේෂණය, (ඇ) ෆීනෝටයිපික් පරීක්ෂාව සහ (ඈ) ඉලක්කගත ජාන විශ්ලේෂණය වැනි පියවර හතරක් ඇතුළත් වේ. TNBC හි MAPK මාර්ගයේ අසාමාන්‍ය සක්‍රියතාවයක් තිබුණද, PTEN, RB1 සහ TP53 වැනි පිළිකා මර්දන ජානවල විකෘති රැගෙන යන TNBC රෝගීන් සඳහා MEK ඉලක්කගත චිකිත්සාවේ සායනික පුරෝකථනය ඉතා දුර්වලය.
මීට අමතරව, CRISPR/Cas9 භාවිතා කරන ලද ජාන පිළිමළුන් පිටුදැකීමේ තිරයක් මගින්, MDA-MB-231 මත ඩිහයිඩ්‍රොකැට්‍රෝල් වල බලපෑම තේරුම් ගැනීම සඳහා, ග්වාතමාලාවේ මල් සහ කොළ සාරයන්හි බහුලව ඇති ඩිහයිඩ්‍රොකැට්‍රෝල් වඩාත් ප්‍රබල සහ තෝරාගත් අණුව වන ඩිහයිඩ්‍රොකැට්‍රෝල් පරීක්ෂා කරන ලදී. තෝරාගත් සෛල සයිටොටොක්සිසිටි යාන්ත්‍රණ. TNBC උප වර්ගවල මෙසෙන්චයිමල් කඳේ ලක්ෂණ. මෙම CRISPR/Cas9 මත පදනම් වූ තිරය මගින් හෙළි වූයේ 17β-හයිඩ්‍රොක්සිස්ටෙරොයිඩ් ඩිහයිඩ්‍රොජිනේස් වර්ගය 11 කේතනය කරන ජානයක් වන HSD17B11, MDA-MB-231 සෛල තුළ බෙහෙවින් ප්‍රකාශ වන බවත් MDA-MB-231 සෛල සඳහා විශේෂිත ඩිහයිඩ්‍රොෆල්කරිනෝල් ඇති කරන බවත්ය (ග්‍රාන්ට් සහ වෙනත් අය, 2020). මේ අනුව, මෙයින් ඇඟවෙන්නේ CRISPR/Cas9 ජානමය පරීක්ෂාව මගින් විභව ස්වාභාවික සංයෝගවල පිළිකා නාශක ගුණාංගවලට යටින් පවතින යාන්ත්‍රණ හඳුනා ගැනීමේදී විශාල විභවයක් ඇති බවයි.
ඊට අමතරව, පිළිකා සඳහා TNBC හි අවදානම, අපක්ෂපාතී ජෙනෝමය-පුළුල් in vivo CRISPR/Cas9 තිරයක් භාවිතයෙන් අධ්‍යයනය කරන ලද අතර, එය ඔන්කොජනික් සහ පිළිකා මර්දන මාර්ග අතර සම්බන්ධයක් පෙන්නුම් කළේය. mTOR සහ Hippo මාර්ගවල ප්‍රධාන සංරචක TNBC හි පිළිකා නියාමනය සඳහා වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරන බව වාර්තා වී ඇත. මීට අමතරව, අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ mTORC1/2 සහ YAP ඔන්කොප්‍රෝටීන් වල ඖෂධීය නිෂේධනය in vitro ඖෂධ-matrix synergy ආකෘතියක් සහ in vivo රෝගී-ව්‍යුත්පන්න xenografts භාවිතයෙන් TNBC හි ව්යාධිජනක බව ඵලදායී ලෙස වළක්වන බවයි. එපමණක් නොව, Torin-1-මැදිහත් වූ mTORC1/2 නිෂේධනය macropinocytosis වැඩි දියුණු කරන අතර, verteporfin-induced YAP නිෂේධනය TNBC සෛල මරණයට හේතු වේ. එකට ගත් කල, මෙම ප්‍රතිඵල TNBC සඳහා නව සහ ඵලදායී ප්‍රතිකාර හඳුනා ගැනීම සඳහා ජෙනෝමය-පුළුල් in vivo CRISPR පරීක්ෂාවේ බලය සහ ශක්තිමත් බව ඉස්මතු කරයි (Dai et al., 2021).
ප්‍රතිශක්තිකරණ පද්ධතියේ අක්‍රමිකතාව පිළිකා උත්පාදනයේ වැදගත් සාධකයකි. පිළිකා සෛල, පිළිකා ක්ෂුද්‍ර පරිසරයේ ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛලවල ක්‍රියාකාරිත්වයට බාධා කිරීම සහ ප්‍රතිශක්තිකරණ පද්ධතිය අවදානමට ලක් කිරීම ඇතුළු ආරක්ෂක යාන්ත්‍රණයන් මඟ හැරීමෙන් ප්‍රතිශක්තිකරණ නිෂ්කාශනය මග හරියි. එබැවින්, වැඩිදියුණු කළ ප්‍රතිශක්තිකරණ පද්ධතියක් වර්ධනය කිරීම පිළිකා සමඟ සටන් කිරීමට ප්‍රධාන ප්‍රවේශයක් විය හැකිය. CRISPR/Cas9 මත පදනම් වූ ජාන වෙනස් කිරීම විවිධ දෘෂ්ටිකෝණවලින් ප්‍රතිශක්තිකරණ අක්‍රියතාවයට අදාළ ගැටළු කිහිපයක් ආමන්ත්‍රණය කරයි. පහත සඳහන් මාර්ග හරහා පියයුරු පිළිකාවට එරෙහිව ප්‍රති-පිළිකා ප්‍රතිශක්තිය වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා CRISPR/Cas9 භාවිතා කර ඇත (රූපය 3).
රූපය 3. CRISPR/Cas9 ප්‍රතිශක්ති චිකිත්සාව TNBC සෛල ඉලක්ක කරයි. CDK5 නැතිවීම සහ PDL1 සහ CD155 අඩු කිරීම ප්‍රතිශක්තිකරණ පද්ධතිය වැඩි දියුණු කරයි. ඒ හා සමානව, A2AR නැතිවීම සහ HER2, mucin 1 සහ TEM8 වැනි TAA අඩු කිරීම පිළිකා සෛල විනාශ කිරීමේදී CAR-T සෛලවල කාර්යක්ෂමතාව වැඩි කළේය. CRISPR/Cas9-ධාවනය කරන ලද T සෛල පරීක්ෂාව මගින් p38 kinase හි බාධා කිරීම් T සෛල ප්‍රතිදේහ ක්‍රියාකාරිත්වය වැඩි දියුණු කරන බව පෙන්වා දී ඇත. CRISPR/Cas9 මගින් වෙනස් කරන ලද T සෛල TCR (T සෛල ප්‍රතිග්‍රාහක) ප්‍රකාශනය වැඩි කරයි, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස T සෛල ප්‍රතිදේහ ක්‍රියාකාරිත්වය ඇති කරයි.
ප්‍රතිශක්තිකරණ චිකිත්සාවේ ඉලක්කය වන්නේ පිළිකා සෛල වලට පහර දීම සඳහා ප්‍රතිශක්තිකරණ පද්ධතිය උත්තේජනය කිරීමයි. ප්‍රතිශක්තිකරණ චෙක්පොයින්ට් ප්‍රෝටීන අධික ලෙස ප්‍රකාශ කිරීම සාමාන්‍යයෙන් ස්වයං ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතික්‍රියා වළක්වයි, නමුත් පිළිකා ඒවා වළක්වා ගැනීමට උපකාරී විය හැකිය (Topalian et al., 2015). මෙම ප්‍රෝටීන ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල මතුපිට ඇති ප්‍රතිග්‍රාහකවලට බන්ධනය වීමෙන් ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතික්‍රියා වළක්වයි. බහු චෙක්පොයින්ට් ප්‍රෝටීන (CD155 සහ PD-L1 වැනි) ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල මත PD-1 ප්‍රතිග්‍රාහකය ඉලක්ක කරන අතර පියයුරු පිළිකා වලදී ප්‍රකාශ වේ, විශේෂයෙන් TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). CRISPR/Cas9 භාවිතා කරමින් PD-L1 හෝ එහි ප්‍රතිග්‍රාහකය තට්ටු කිරීමෙන් TNBC පිළිකා වලට පහර දීමට ප්‍රතිශක්තිකරණ පද්ධතිය උත්තේජනය කළ හැකිය (Yahata et al., 2019). ඊට අමතරව, CRISPR/Cas9 මැදිහත් වූ CDK5 මකා දැමීම හරහා PD-L1 ප්‍රකාශනය අඩු කිරීම, විට්‍රෝ සහ වීවෝ තුළ පිළිකා වර්ධනය වළක්වන බව පෙන්වා දී ඇත (ඩෙන් සහ වෙනත් අය, 2020). පියයුරු පිළිකා වල in vitro සහ in vivo ආකෘතිවල වර්ධන නිෂේධනය යෝජනා කරන්නේ shRNA-මැදිහත් වූ CD155 අඩු කිරීම පියයුරු පිළිකාවට චිකිත්සක බලපෑමක් ඇති කළ හැකි බවයි (Gao et al., 2018).
CAR T සෛල මගින් පිළිකා ආශ්‍රිත ප්‍රතිදේහජනක (TAAs) හඳුනා ගන්නා CAR ප්‍රකාශ කරන අතර ඒවායේ ක්‍රියාකාරිත්වය වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා චෙක්පොයින්ට් ප්‍රෝටීන තට්ටු කිරීම භාවිතා කළ හැකිය (Li C. et al., 2020). පියයුරු පිළිකා වලදී CAR T සෛල චිකිත්සාව සඳහා විවිධ විභව ඉලක්ක තිබේ, HER2, mucin1 සහ TEM8 වැනි TAA කිහිපයක් ඇතුළුව (Bajgain et al., 2018). CRISPR/Cas9 භාවිතයෙන් PD-1 ඉවත් කරන විට මෙසොතලින් (TNBC BT-459 සෛලවල අධික ලෙස ප්‍රකාශිත) ඉලක්ක කරන CAR T සෛල පිළිකාවට එරෙහිව වඩාත් ඵලදායී බවට සාක්ෂි තිබේ (Hu et al., 2019). කෙසේ වෙතත්, රෝගීන්ගෙන් T සෛල හුදකලා කිරීම සහ පසුව ඒවා ex vivo සංස්කරණය කිරීම ශ්‍රමය-දැඩි සහ කාලය ගතවන ක්‍රියාවලියකි. විශ්වීය T සෛල මගින් හුදකලා අවශ්‍යතා අඩු කළ හැකි වුවද, බද්ධ-එදිරිව-ධාරක අසාමාන්‍යතා වැළැක්වීම සඳහා මානව ලියුකෝසයිට් ප්‍රතිදේහජනක (HLA) පන්තිය I සහ T සෛල ප්‍රතිග්‍රාහක (TCR) ප්‍රකාශ කරන පරිත්‍යාගශීලී T සෛල ඉවත් කළ යුතුය (Ren et al., 2017). , 2017a). CRISPR/Cas9 භාවිතා කිරීමෙන්, HDR එකවර TCR සහ HLA ඉවත් කර CAR කේතනය කරන ජානය ඉවත් කළ හැකිය. අධ්‍යයනවලින් පෙන්වා දී ඇත්තේ CRISPR/Cas9 TCR ස්ථානයට ප්‍රති-CD19 CAR හඳුන්වා දීමට භාවිතා කළ හැකි බවත්, එමඟින් T සෛල ක්ෂය නොකර CAR කාර්යක්ෂමව නිපදවන බවත්ය (Dimitri et al., 2022). TCR, බීටා-2-මයික්‍රොග්ලොබියුලින් (B2M), HLA-I උප ඒකකය සහ PD-1 සහ CTLA-4 වැනි අනෙකුත් ප්‍රෝටීන එකවර ඉවත් කිරීමෙන් ඇලෝජෙනික් CAR T සෛල ජනනය කිරීම සඳහා බහුකාර්ය තාක්ෂණයන් සංවර්ධනය කර ඇත, ඒවාට වැඩි පිළිකා නාශක ගුණ තිබිය හැකිය. TNBC වලට එරෙහිව (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
CRISPR/Cas9 භාවිතා කිරීමෙන් CAR-T සෛලවල කාර්යක්ෂමතාව වැඩි දියුණු කළ හැකිය. ඇඩෙනොසීන් ප්‍රතිශක්තිකරණ මර්දන ගුණ ඇති බව දන්නා අතර T සෛල ක්‍රියාකාරිත්වය අවහිර කිරීමෙන් සහ ඇඩෙනොසීන් A2A ප්‍රතිග්‍රාහක සක්‍රීය කිරීමෙන් පිළිකා නාශක ප්‍රතිශක්තිය අඩු කළ හැකිය (A2AR) (Vigano et al., 2019). CRISPR/Cas9 භාවිතා කරමින් A2AR නිහඬ කිරීම CAR-T සෛලවල කාර්යක්ෂමතාව සැලකිය යුතු ලෙස වැඩිදියුණු කළේය (Giuffrida et al., 2021). T සෛල සෛල ප්‍රසාරණය, අවකලනය, ඔක්සිකාරක ආතතිය සහ ජානමය ආතතිය වැනි විවිධ ෆීනෝටයිපික් ලක්ෂණ පෙන්නුම් කරන බව දන්නා කරුණකි. CRISPR/Cas9 මත පදනම් වූ T සෛල පරීක්ෂාව මගින් විවිධ T සෛල ප්‍රතිග්‍රාහක කයිනේස් 25 ක බාධාවක් අනාවරණය විය. ඒවා අතර, p38 කයිනේස් මකා දැමීම T සෛලවල පිළිකා නාශක ක්‍රියාකාරිත්වය වැඩි දියුණු කරන බව පෙන්වා දී ඇති අතර, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ p38 කයිනේස් CAR-T සෛල නියාමනයේ ප්‍රධාන නියාමකයෙකු බවයි (ගුරුසාමි et al., 2020).
CRISPR/Cas9 භාවිතයෙන් T සෛල ජානමය වශයෙන් වෙනස් කර ඉහළ ප්‍රකාශිත TCR නිපදවිය හැක. ජානමය වශයෙන් වෙනස් කරන ලද T සෛල රෝගීන්ට මාරු කිරීම අන්තරාසර්ග T සෛල වලට වඩා ශක්තිමත් පිළිකා නාශක ක්‍රියාකාරිත්වයක් පෙන්නුම් කර ඇත. එබැවින්, අන්තරාසර්ග TCR රෝගීන් තුළ ජානමය වශයෙන් වෙනස් කරන ලද TCR සමඟ තරඟ කළ හැකි අතර, එය පිළිකා ප්‍රතිශක්ති චිකිත්සාවේ විභවයට බලපෑම් කළ හැකිය. මෙම ගැටළුව මඟහරවා ගැනීම සඳහා, CRISPR/Cas9 භාවිතා කිරීමෙන් ලබන්නාගේ සෛල තුළ අන්තරාසර්ග TCR-β ඉවත් කර පසුව TCR-β T සෛල පිළිකා රෝගීන්ට මාරු කිරීමෙන් අන්තරාසර්ග TCR ලිංගික තරඟකාරිත්වයකින් තොරව වඩා හොඳ පිළිකා නාශක ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාර පෙන්නුම් කළ හැකිය (Fan et al. 2018). මේ අනුව, CRISPR-වෙනස් කළ T සෛල හැර, TCR සාමාන්‍ය TCR-සම්ප්‍රේෂණය කරන ලද T සෛල වලට වඩා පිළිකා ප්‍රතිදේහජනක වලට දහස් ගුණයකින් සංවේදී වේ. ඊට අමතරව, විවිධ ලියුකේමියාවන්හිදී, γδ TCR+ CRISPR මගින් ජනනය කරන ලද වෙනස් කරන ලද T සෛල සම්මත TCR හුවමාරුවට වඩා CD4+ සහ CD8+ T සෛලවල ඉහළ ප්‍රකාශනයක් පෙන්නුම් කරයි (Legut et al., 2018). මේ අනුව, CRISPR/Cas9 මගින් ජනනය කරන ලද වෙනස් කරන ලද T සෛල TNBC ජය ගැනීම සඳහා ඵලදායී ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිකාර ක්‍රමයක් විය හැකිය.
ඉන්ටෙග්‍රින් යනු සෛලීය ට්‍රාන්ස්මෙම්බ්‍රේන් වල පවතින සෛල ඇලවුම් අණු වන අතර සෛල බාහිර සෛලීය අනුකෘතියට (ECM) බන්ධනය ප්‍රවර්ධනය කරයි (Hamidi and Ivaska, 2018). ඉන්ටෙග්‍රින් වල අක්‍රමිකතාව පිළිකා වර්ධනය හා සංක්‍රමණය සමඟ සම්බන්ධ වී බාහිර සෛලීය අනුකෘතිය වෙනස් කිරීමෙන් පිළිකා සෛල පැවැත්මට හේතු වේ (Hamidi and Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-මැදිහත් වූ ඉන්ටෙග්‍රින් නොක්ඩවුන් කිරීම TNBC හි පිළිකා ප්‍රගතිය, මෙටාස්ටැසිස් සහ ජනපදකරණය මන්දගාමී කරයි. ඉන්ටෙග්‍රින් a5 (ITGA5) නොක්ඩවුන් කිරීම පෙනහළු පිළිකා වැනි අනෙකුත් පිළිකා වල සෛල සංක්‍රමණය සහ ප්‍රගතිය අඩු කරන බව වාර්තා වී ඇත (Ju et al., 2017), ඉන්ටෙග්‍රින් a5 TNBC හි ව්‍යාධිජනක ක්‍රියාවලියේදී ද ප්‍රධාන සාධකයක් විය හැකි බව යෝජනා කරයි.
සාම්ප්‍රදායික කළල කඳ (ES) සෛල ක්‍රම භාවිතයෙන් නොක්අවුට් මීයන් ජනනය කිරීම ශ්‍රමය වැය වන, කාලය ගතවන සහ අකාර්යක්ෂම ක්‍රියාවලියකි. සමජාතීය නැවත එකතු කිරීම හරහා ES සෛල ඉලක්ක කර, චිමරික් මීයන් බෝ කර, පසුව විෂමජාතීය මීයන් සමඟ ඒවා තරණය කර සමජාතීය දරුවන් බිහි කිරීමට මාස සහ වසර ගණනාවක් ගත වේ. බහු ජාන විකෘති සහිත මීයන් නිර්මාණය කිරීම සඳහා සංකීර්ණ හරස් අභිජනනය අවශ්‍ය වේ. කෙසේ වෙතත්, CRISPR/Cas9 භාවිතයෙන් ES සෛල ඉවත් කිරීමෙන් හෝ CRISPR/Cas9 සංරචක තනි සෛල සංසේචනය කළ බිත්තරවලට ක්ෂුද්‍ර එන්නත් කිරීමෙන් ජනනය වන මීයන් භාවිතා කරන විට බොහෝ ගැටළු මතු වී ඇත. උදාහරණයක් ලෙස, වෙනස්කම් හඳුන්වාදීම බොහෝ විට ද්විමය ස්ථානවල සිදු වන අතර එය ජාන විශේෂිත නොවේ. CRISPR/Cas9 තාක්ෂණය භාවිතා කරන ES සෛල වලට ජාන 5ක් දක්වා එකවර ද්විමය විකෘති ඇතුළත් කළ හැකි බව මෑතකදී වාර්තා විය (නිෂිසෝනෝ සහ වෙනත් අය, 2021). මෙම අරමුණ සඳහා, Cas9 mRNA සහ ජාන-විශේෂිත gRNA පහක් එකවර ES සෛල තුළට මාරු කරන ලදී. මෙය මෙම ක්‍රියා පටිපාටියේ පොරොන්දුව සහ ඵලදායීතාවය ඉස්මතු කරයි, නමුත් මෙම විකෘති පංච පුර්ණ නොක්අවුට් මීයන් නිපදවීමට ආරම්භක රේඛා අභිජනනය කළ විට සම්ප්‍රේෂණය වී තිබිය හැකිය. අධ්‍යයනයෙන් පුදුම සහගත සොයාගැනීමක් ද වාර්තා වේ: ජානමය වශයෙන් වෙනස් කරන ලද මීයන් නිර්මාණය කිරීමට ES සෛල තවදුරටත් අවශ්‍ය නොවේ. ඒ වෙනුවට, නිශ්චිත ජාන නිෂ්පාදන ඉවත් කිරීම සඳහා, Cas9 mRNA සහ gRNA තනි සෛල අවධියේ කළල වලට එන්නත් කරන ලදී. එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස, මීයන් තුළ ජාන මකාදැමීමේ ප්‍රතිවිපාක අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා න්‍යායාත්මකව භාවිතා කළ හැකි නොක්අවුට් ආරම්භක රේඛා නිර්මාණය කර ඇත (Qin et al., 2016). මේ අනුව, CRISPR/Cas9 සාම්ප්‍රදායික ජාන ඉංජිනේරු විද්‍යාවට වඩා අඩු වියදමකින් TNBC ප්‍රතිකාර කිරීම සඳහා සංක්‍රාන්ති මීයන් නිර්මාණය කිරීමට ඉඩ සලසයි. CRISPR/Cas පද්ධතිය භාවිතා කරමින්, TNBC හි ආවේණික ජාන එකක හෝ වැඩි ගණනක ලක්ෂ්‍ය විකෘති සාර්ථකව හඳුන්වා දිය හැකි නව නොක්අවුට් මූසික ආකෘතියක් සංවර්ධනය කර ඇත. මෙම සංකල්පය මත පදනම්ව, TNBC හි සත්ව ආකෘති CRISPR/Cas9-මැදිහත් වූ BRCA1 සහ p53 මකාදැමීම භාවිතයෙන් ද සංවර්ධනය කළ හැකි අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස HR අලුත්වැඩියාව, ජානමය අස්ථායිතාව සහ විකෘති ෆීනෝටයිප් නැතිවීම සිදුවේ (Annunziato et al., 2020).
වර්තමානයේ, මැමෝග්‍රැෆි, චුම්භක අනුනාද රූප (MRI) සහ අල්ට්රා සවුන්ඩ් වැනි විවිධ ක්‍රම TNBC රෝග විනිශ්චය සඳහා භාවිතා කරයි. කෙසේ වෙතත්, මෙම ක්‍රමවලට යම් සීමාවන් තිබේ. පිළිකා සෛල වෙනත් අවයව වලට සංක්‍රමණය වී ඇති මෙටාස්ටේස් වලට වඩා දේශීය පියයුරු පටක හඳුනා ගැනීමට මැමෝග්‍රැෆි භාවිතා කරයි. අල්ට්රා සවුන්ඩ් සහ ලී-ෆෙල්කර්, 2023). අල්ට්රා සවුන්ඩ් සහ මැමෝග්‍රැෆි වලට වඩා MRI ඉහළ සංවේදීතාවයක් ඇත, නමුත් එහි රෝග විනිශ්චය නිරවද්‍යතාවය සීමිතය (ෂා සහ චෙන්, 2022). පටක බයොප්සි යනු පිළිකා සෛල හඳුනා ගැනීමට ආක්‍රමණශීලී ක්‍රමයකි. කෙසේ වෙතත්, සමහර අවස්ථාවලදී, ඉඳිකටුවක් උනන්දුවක් දක්වන ප්‍රදේශයෙන් ඉවතට ගියහොත් බයොප්සි මගින් පිළිකා පටක මග හැරිය හැක. ඊට අමතරව, එය ඉතා මිල අධික වන අතර රෝගියාට කම්පන සහගත විය හැකිය. TNBC යනු විෂමජාතීය පිළිකා වර්ගයකි, එබැවින් බයොප්සි මගින් පිළිකා වර්ගය පිළිබඳ ප්‍රමාණවත් තොරතුරු ලබා නොදෙනු ඇත. එබැවින්, TNBC හඳුනා ගැනීම සඳහා නව රෝග විනිශ්චය කිරීමේ විශ්වාසදායක ක්‍රමයක් හදිසි අවශ්‍ය වේ. CRISPR/Cas9 පියයුරු පිළිකා රෝග විනිශ්චය සඳහා ඉතා සංවේදී සහ අවම ආක්‍රමණශීලී විකල්පයක් ලෙස සේවය කළ හැකිය. මේ සඳහා, TNBC රෝග විනිශ්චය සඳහා PCR ක්‍රම වැඩිදියුණු කිරීම සඳහා CRISPR/Cas9 මත පදනම් වූ උපාය මාර්ග භාවිතා කළ හැකිය. පළමුව, CRISPR පද්ධතියේ Cas9 සහ cpf1 ප්‍රෝටීන නිශ්චිත නොවන DNA ඉවත් කිරීමට භාවිතා කරන අතර, පසුව මෙම ප්‍රෝටීන දෙක (Cas9 සහ cpf1) ඉලක්කගත DNA වලට බන්ධනය වීමට පෙර PAM අනුක්‍රමය හඳුනාගත හැකිය (දීපක් සිං සහ වෙනත් අය, 2021). . මේ අනුව, PCR පිළිකා වර්ධනයට සම්බන්ධ විකෘති හඳුනාගත හැකිය. විවිධ පිළිකා වල විවිධ විකෘති හඳුනා ගැනීම සඳහා අධ්‍යයන කිහිපයක් මෙම CRISPR මත පදනම් වූ උපාය මාර්ගය අනුගමනය කර ඇත (Safari සහ වෙනත් අය, 2019). මේ අනුව, CRISPR මත පදනම් වූ PCR ක්‍රම මගින් ජෛව විද්‍යාත්මක ප්‍රතිශක්තිකරණ රසායන විද්‍යාව වැනි ආක්‍රමණශීලී ක්‍රම මත TNBC රෝග විනිශ්චය යැපීම අඩු කළ හැකිය.
හෝමෝන ප්‍රතිග්‍රාහක නියාමනයේ ජානමය වෙනස්කම් TNBC හි ද පෙන්නුම් කර ඇත (චෙන් සහ රුසෝ, 2009). සත්කාර රෝග විනිශ්චය සඳහා ක්ෂුද්‍ර කිරණ භාවිතා කරන CRISPR/Cas9 මත පදනම් වූ PCR උපාය මාර්ග මගින් මෙම විකෘති ඵලදායී ලෙස නිරීක්ෂණය කළ හැකිය (Hajian et al., 2019). එමඟින් TNBC රෝගීන්ගේ නිශ්චිත විකෘති පිළිබඳ අදාළ තොරතුරු සෞඛ්‍ය සේවා සපයන්නන්ට ලබා දිය හැකි අතර, එමඟින් ඔවුන්ගේ ප්‍රතිකාර ක්‍රමය වැඩිදියුණු කිරීමට උපකාරී වේ. කෙසේ වෙතත්, මෙම ඒකාබද්ධ තාක්ෂණයට සීමාවන් ඇත. එබැවින්, TNBC රෝග විනිශ්චය සඳහා සෞඛ්‍ය සේවා ක්ෂේත්‍රයේ මෙම CRISPR/Cas-PCR ක්‍රමය භාවිතා කිරීමට පෙර පුළුල් පර්යේෂණ උත්සාහයන් අවශ්‍ය වේ (Yang et al., 2019).